UNIVERSITE DES SCIENCES ET DE LA TECHNOLOGIE REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE DES SCIENCES ET DE LA TECHNOLOGIE « HOUARI BOUMEDIENE » Domaine: Sciences de la Nature et de la Vie Spécialité :Génétique du Développement Technique PCR-SSP: Application au Typage HLA en Transplantation Rénale Session 2014/2015 Présenté par: - GHOULI YASMINE

Transplantation Rénale En effet, cette intervention améliore non seulement la qualité de vie des patients mais prolonge aussi leur vie. Depuis 1986, environ 1200 transplantations du rein à partir de donneurs vivants contre 12 seulement prélevés sur des cadavres Rejet de l'organe transplanté = Obstacle à la Transplantation rénale allogénique

Patient en Bilan prégreffe Bilan immunologique en transplantation Rénale Greffe Typage HLA Suivi Post greffe Patient en Bilan prégreffe Cross Match initial Recherche et étude des Anticorps (Ac) anti-HLA Cross Match Final Recherche et étude d’Ac anti HLA Sérothèque Echanges avec cliniciens / Recueil des informations Médicales +++ ATCD immunisants ( transfusions, grossesses, greffes)

Système HLA Complexe majeurs d’histocompatibilité codés par des gènes situés sur le chromosome 6 Déterminent la compatibilité tissulaire entre deux individus  Rôle majeur dans le rejet

Genès et molécules HLA de classe I et II Figure 2 : organisation des Genès et molécules HLA de classe I et II

Polymorphisme Il correspond au fait que chaque gène est polyallélique . résulte de différences nucléotidiques secondaires à des mutations ou à des phénomènes de conversion géniques. Actuellement on denombre 9749 allèles de classe I et plus de allèles 3274 allèles de classe II. Figure  : Nombre d’allèles détectés par technique de biologie moléculaire (1987- 2015)

> Etude du polymorphisme HLA Techniques de Typage HLA DR4 Sérologique Biologie Moléculaire A2 A3 Identification des Antigènes (Ag) exprimés à la surface des cellules A A3 B7 DR4 Définition des allèles au niveau de l’ADN génomique B A2 B27 DR5 Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR-SSO PCR-SBT PCR-SSP Micro-Lymphocytotoxicité complement- dependente

De grandes Applications de la PCR permettent actuellement la réalisation du typage à différents niveaux de résolution Chromosome Homologue Site de restriction ……… Sonde radioactive Electrophorèse des produits de PCR PCR-SSO PCR-SBT PCR-RFLP

Objectif de notre Travail Montrer l’apport la PCR-SSP à l’étude du polymorphisme HLA. Typage HLA de 15 patients et de leurs Donneurs vivants apparentés Figure: Lien de parenté entre D/R des couples explorés

Après extraction de L’ADN Typage HLA Classe II Locus DR Classe I Locus A et Locus B Technique PCR-SSP Après extraction de L’ADN Par chromatographie d’affinité à base de silice.

Technique PCR-SSP Principe: Réaction Positive Réaction Négative Electrophorèse sur gel:

PCR-SSP Mode opératoire: Le Kit utilisé est : Olerup SSP® HLA-A, HLA-B/ HLA-DR Avec Taq-polymerase Plaque de typage HLA Master Mix

Migration et Révélation Pré-amplification + + Eau distillée ADN Master Mix Amplification Migration et Révélation Interprétation

Migration et Révélation Pré-amplification Amplification Migration et Révélation Interprétation

Migration et Révélation Pré-amplification Amplification Migration et Révélation Interprétation

Migration et Révélation Pré-amplification Amplification Migration et Révélation Interprétation

Degré de compatibilité Couples D/R Génotypage Degré de compatibilité Locus A Locus B Locus DR N01 D1 A*02 A*24 B*44 B*51 DRB1*04 DRB1*06 Haplo-identiques R1 A*02 A*03 B*44 B*07 DRB1*04 DRB1*15 N02 D2 A*03 A*03 B*14 B*47 DRB1*01 DRB1*04 Géno-identiques R2 N03 D3 A*02 A*32 B*50 B*58 DRB1*07 DRB1*16 R3 A*02 A*40 B*57 B*58 DRB1*15 DRB1*16 N04 D4 A*01 A*26 B*49 B*18 R4 A*01 A*02 B*49 B*58 DRB1*04 DRB1*11 N05 D5 A*11 A*80 B*44 B*52 DRB1*04 DRB1*07 R5 A*30 A*80 B*44 B*50 DRB1*04 DRB1*13 N06 D6 A*01 A*29 B*39 B*50 DRB1*07 DRB1* 11 Géno-differents R6 A*25 A*26 B*18 B*38 DRB1*15 DRB1* 13 N07 D7 A*02 A*68 B*51 B*53 DRB1*13 DRB1* 03 R7 N08 D8 A*02 A*02 B*40 B*50 R8 N09 D9 A*11 A*02 DRB1*15 DRB1* 16 R9 A*30 A*02 N10 D10 R10 A*02 A*11 A*02 A*80 B*51 B*58 B*44 B*58 DRB1* 03 DRB1*13 DRB1* 04 DRB1*13 N11 D11 A*11 A*30 B*35 B*45 DRB1*03 DRB1*04 R11 A*03 A*30 B*35 B*18 DRB1*03 DRB1*11 N12 D12 A*32 A*68 B*08 B*40 DRB1*04 DRB1*03 R12 A*03 A*68 B*14 B*40 DRB1* 04 DRB1*11 N13 D13 B*18 B*50 DRB1*03 DRB1* 04 R13 B*18 B*51 DRB1*01DRB1* 04 N14 D14 A*32 A*24 B*14 B*44 DRB1* 04 DRB1*16 Géno-différent R14 A*68 A*02 B*58 B*50 DRB1* 13 DRB1*03 N15 D15 A*24 A*68 B*35 B*53 DRB1*11 DRB1*14 D15' A* 24 A*23 B*35 B*50 DRB1*11 DRB1*07 R15

néphropathie d’origine indéterminée Etude des cas clinique: Cas clinique Receveur Donneur (Mère) Age 30 ans 56 ans Etiologie IRCT néphropathie d’origine indéterminée Antécédents transfusionnels / Groupe sanguin  A Rhésus positif Cross Match: LCT-AGH Ac s anti-HLA: Luminex Négative Classe I Classe II Négative Négative Genotypage HLA par la technique PCR-SSP R: A*02 A*03 B*44 B*07 DRB1*04 DRB1*15 Haplo-identiques D: A*02 A*24 B*44 B*51 DRB1*04 DRB1*06 La transplantation rénale est possible chez ce couple haplo-identique avec l’absence d’ Ac anti-HLA de classe I et II recherchés.

Evénements Immunisants Vaccination anti-HBS. Groupe sanguin Cas clinique Receveur Donneur (Soeur) Age 43 ans 38ans Etiologie IRCT indéterminée Evénements Immunisants Vaccination anti-HBS. Groupe sanguin  O Rhésus positif Cross Match: LCT-AGH Ac s anti-HLA: Luminex Négative Classe I Classe II Négative Négative Genotypage HLA par la technique PCR-SSP R: A*25 A*26 B*18 B*38 DRB1*15 DRB1* 13 Géno-différents D : A*01 A*29 B*39 B*50 DRB1*07 DRB1* 11 Conclusion: La transplantation rénale est possible bien que le couple est Géno-différent par ce qu’il s’agit d’un receveur non immunisé dans le système HLA (la recherche des Ac Anti-HLA est négative), le traitement immunosuppresseur IS en post greffe devrait être plus lourd.

néphroangiosclérose maligne. Cas clinique Receveur Donneur1 (frère) D2 (sœur) Age 60 ans 62 ans 58 ans Etiologie IRCT néphroangiosclérose maligne. Antécédents transfusionnels 02 Groupe sanguin  A Rhésus positif Cross Match: LCT-AGH Ac s anti-HLA: Luminex Négative Classe I Classe II Négative Négative Genotypage HLA par la technique PCR-SSP R : A*24 A*68 B*35 B*53 DRB1*11 DRB1*14 D 1 : A* 23 A*24 B*35 B*50 DRB1*07 DRB *11 D 2 : A*24 A*68 B*35 B*53 DRB1*11 DRB1*14 Conclusion: Le typage HLA nous a permis de sélectionner le meilleur donneur qui est le Géno-identique. Le traitement IS post greffe dans ce cas là est moins lourd.

Cas clinique Receveur Donneur (Soeur) Age 55 ans 31ans Etiologie IRCT maladie de berger. Evènements immunisants Vaccination anti-HBS 2 transfusions Groupe sanguin  O Rhésus positif B Rhésus positif Cross Match: LCT-AGH Ac s anti-HLA: Luminex Négative Classe I Classe II Genotypage HLA par la technique PCR-SSP R: A*02 A*68 B*51 B*53 DRB1*13 DRB1* 03 D: A*02 A*68 B*51 B*53 DRB1*13 DRB1* 03 Positive anti-B*42 anti B*07 Géno-identiques Conclusion : malgré la présence d’Ac anti-HLA de classe I mais ces derniers sont autorisés car ils ne sont pas dirigés contre les Ag HLA du donneur. Le donneur étant Géno-identique au receveur. La transplantation rénale chez ce couple est possible

néphropathie hypertensive Cas clinique Receveur Donneur (frère) Age 23 ans 28 ans Etiologie IRCT néphropathie hypertensive Evènements immunisants 2 Transfusions Groupe sanguin  O Rhésus positif Cross Match: LCT-AGH Ac s anti-HLA: Luminex Négative Classe I Classe II Genotypage HLA par la technique PCR-SSP R :A*30 A*02 B*50 B*58 DRB1*07 DRB1*16 D : A*11 A*02 B*57 B*58 DRB1*15 DRB1*16 Positive anti-B*57. Haplo-identiques Conclusion : La recherche des Ac anti-HLA par la technique Luminex est positive en classe I avec présence d’un DSA (Donor-Specific Antibodies) anti B*57. Il s’agit alors d’un Ag interdit pour cette patiente. La greffe n’est pas autorisée 

Conclusion L’essor de la biologie moléculaire a permis d’augmenter la précision du typage HLA sans ambiguïtés au niveau de l’ADN avec une haute résolution et présente beaucoup d’avantages par rapport aux méthodes sérologiques. La technique PCR-SSP est la meilleure approche de la compatibilité HLA entre le donneur et le receveur en transplantation rénale, et par conséquent une meilleure survie du greffon à moyen et à long terme.