Morphométrie La segmentation a donc permis à l’analyseur de reconnaître des éléments qui doivent faire l’objet de mesures. La paramétrisation va ensuite permettre de réaliser les mesures souhaitées sur les objets sélectionnés.

ETALONNAGE L’utilisation d’un logiciel de mesure nécessite un étalonnage préalable. Il faut faire correspondre une longueur ( ou une surface) à un nombre de pixels connus. Cet étalonnage doit être établi soigneusement à l’aide par exemple de lame calibrée pour la MO De grilles d’étalonnage pour la ME

L’opérateur prendra soin d’effectuer toutes ses mesures en conservant la même échelle pour ses images sources, ou le même grossissement au microscope. Le microscope lui-même doit être régulièrement vérifié. On doit également, tout au long d’une campagne de mesures, s’assurer que les résultats sont cohérents.

Les variables les plus utilisées sont: Des paramètres morphologiques (diamètre, longueur, surface) Des paramètres de répartition (dénombrement des objets)

Les notions de morphométrie appliquées à l’ana path découlent du principe du géologue A. Delesse qui a montré en 1848 que la fraction d’aire (surface du constituant étudié/ surface de la coupe de roche) est directement proportionnelle à la fraction volumique de ce constituant dans la roche: s/S=v/V Les images en 2 D permettent donc d’évaluer ce qui se passe en 3D .

LOGICIEL Il existe plusieurs logiciels de traitement de l’image et de mesures. Au laboratoire nous utilisons le logiciel CYBERVIEW. Ce logiciel permet une acquisition à partir de la camera dont est équipé le JEOL 1010. Il offre la possibilité d’améliorer l’image et surtout d’effectuer des mesures .

RESULTATS Les valeurs obtenues peuvent ensuite être envoyées sur un tableur pour permettre une analyse statistique des résultats ou bien les exploiter sous forme de graphique. On peut traiter des images photoniques (colorées) déjà numérisées.

Applications en Ana-Path 1-Mesure de l’importance relative de divers éléments représentés sur une coupe a. Estimation de la fibrose dans le cortex rénal: La coloration par le picroSirius permet une analyse fine de l’importance et de la topographie de la fibrose en faisant apparaître les fibres de collagène en rouge orange.

Exemple de seuillage

Résultat du filtrage

Utilisation du négatif :comptage des taches blanches

Cortex rénal coloré au PicroSirius

Après seuillage et filtrage

b- Quantification du matériel membranoïde dans un glomérule rénal. Imprégnation argentique des fibres de collagène par la technique de Marinozzi. Elle fait apparaître en noir le collagène III,constituant le matériel membranoïde.

Cortex rénal Marinozzi

Glomérule ( Marinozzi)

Résultat du filtrage après seuillage

2-Morphologie : Mesure de l’épaisseur des membranes basales glomérulaires dans le cas d’un diabète 2µm

Mesure de l’épaisseur de la basale du capillaire glomérulaire (Alport)

3-Quantification d’un marqueur: Il s’agit d’un dénombrement Cette quantification passe par la réalisation d’un marquage (réaction antigène anticorps couplé à la peroxydase) Ex: marquage nucléaire dans le cas de gliome avec l’anti-P53 ou l’anti-topoisomérase. Les cellules tumorales apparaissent alors en brun et peuvent être dénombrées.

Gliome marquage peroxydase

Après traitement

LIMITES Il n’existe pas sur le marché de logiciel spécifique à la biologie. Les limites de ces techniques sont liées au matériel lui-même: Matériel biologique de qualité. L’isotonicité des fixateurs et des tampons permet de limiter les phénomènes de rétraction des structures Coloration ou contraste (cf difficultés de seuillage) A la technologie (micro, caméra…) Reproductibilité (lecture par une même personne)