LE MODELE ASCIDIE EN BIOLOGIE DU DEVELOPPEMENT Spécification de destinées cellulaires au cours de l’embryogénèse d’un chordé. Vincent Picco, Clare Hudson et Hitoyoshi YASUO CNRS/UPMC UMR7009 Biodev Observatoire Océanologique de Villefranche-sur-Mer Etude de l’embryologie d’organismes dits modèles a depuis longtemps mis en évidence une grande conservation de certains mécanismes responsables de l’élaboration d’un embryon (voies de signalisation notamment)

Position phylogénétique et génome En plus, génome de deux espèces d’ascidies est séquencé. Ont un génome très simple comparé aux autres chordés donc peu de gènes et donc peu de redondance dans la fonction desdits gènes (facilite grandement études fonctionnelles notamment) DEUTEROSTOMES

Un embryon simple au patron de division invariant 8-cell 16-cell 32-cell 44-cell 64-cell 110-cell végétative vue animale vue NC Not En Mes Mus

Etudes fonctionnelles Manipulations embryologiques Mutagénèse Jiang et al. (2005) Microinjection Electroporation dévelopt. (3hrs) Harafuji et al. (2002)

Un signal FGF est responsable de la spécification du destin notochorde FGF9/16/20 pathway disruption A6.2 A6.4 A7.7 neural A7.8 neural A7.3 neural A7.4 neural A7.4 neural A6.2 A7.3 notochord A7.8 neural A6.4 A7.7 notochord We have shown that FGF is required for notochord precursors specification… a differential ERK activity takes pace between notochord and neural precursor, with ERK activated in the notochord precursor but not the neural precursor. FGF is the activator of ERK1/2 Therefore, these precursors undergo an alternative fate choice between neural and notochord fate with differential ERK activity being the critical point. The easiest explanation would be that FGF acts as a localised/directionnal signal activating ERK only in the notochord precursors…. ERK: on ERK: off Notochord fate Neural fate ERK: off Neural fate

Patron d’expression du FGF which is difficult to explain based on FGF9/16/20 expression pattern. FGF is expressed quite broadly in the vegetal cells, including the mother cell of the notochord-neural precursors. Thus FGF9 probably does not act as a directional signal. At that point, we thought there might be a signal which acts to attenuate FGF signalling in the neural precursors.. We obtained evidence from following embryological studies that such signal is indeed present.

Un contact avec les cellules du pôle animal est nécessaire pour la spécification du destin neural 8-cell stage 24-cell stage 32-cell stage 44-cell stage 110-cell stage a4.2 A4.1 A4.1 A4.1 + a4.2 av. 8 cells av. 3.8 cells (notochord) Ci-Bra A4.1 cells from the 8-cell stage gives rise to the noto/neural mother cell and endoderm precursors. By the 110 cell stage, 4 notochord, 4 neural cells and endoderm cells are formed in this lineage. In isolated A4.1 cells, the number of notochord cells is doubled and no neural cells are formed. We hypothesised that a cellular interaction was responsible for inducing neural fate and inhibiting notochord fate. The animal cells contacting the mother cell on the future neural side are good candidate to provide this signal. The a4.2 blastomere of the 8 cell stage is the progenitor f these cells and we found that when A4.1 vegetal and a4.2 animal cells were co-isolated, neural fate was recovered and the number of notochord cells reduced. Thus interaction with animal cells is required to repress notochord and promote neural fate in A-line cells. av. 0 cell av. 4.8 cells Ci-ETR (neural)

Quelle est la nature moléculaire du signal antagoniste au signal FGF? MAPK ON MAPK OFF pôle animal FGF signal fgf induit le destin noto les cellules de lignage neural sont aussi sous l’influence de ce signal fgf MAIS QUE un signal antagoniste du signal FGF et provenant des c pole animal permet la spécification du destin neural

Approche par criblage de gènes candidats Une molécule responsable de l’induction de la destinée neurale par interaction cellulaire devrait: être un antagoniste de la signalisation FGF (éventuellement un antagoniste peu ou non-diffusible) être exprimée aux stades 24-32 cellules dans les blastomères animaux Comment procéder? Approche par gènes candidats

Inhibition de la voie du FGF Les couples ephrin-récepteur Eph peuvent inhiber la voie de signalisation FGF Ciona intestinalis: _4 ephrin A _1 ephrin B _4 récepteurs Eph ephrin A récepteur Eph Inhibition de la voie du FGF Autres régulations (Rho, Ras-GEF, régulateurs du cytosquelette…)‏

Une molécule responsable de l’induction de la destinée neurale par interaction cellulaire devrait: être un antagoniste de la signalisation FGF être exprimée aux stades 24-32 cellules dans les blastomères animaux Comment procéder? Approche par gènes candidats

Analyse du patron d’expression des gènes candidats par hybridation in situ stade 16 cell. stade 24 cell. vue animale One of these ephrins, ephrin-Ad is expressed at the right time and in the right place to be a candidate for the signal from the anterior-animal cells. ephrin-Ad starts to be expressed in the all the animal cells from the 16-cell stage and the expression is maintained during the 24-cell stage. This is a lateral view of the 24-cell stage embryo and the notochord-neural mother cell is indicated here in red. We next addressed if this ephrin was involved in the notochord-neural cell fate choice. vue latérale

Surexpression et knockdown de gènes contrôle ARN ephrinAd MO ephrinAd dnEph3 at 64-cell stage Ci-bra at 110-cell stage Ci-etr We first expressed ephrin-Ad everywhere in the embryo. In the embryo injected with ephrin-Ad RNA, the notochord fate is repressed and the notochord precursors instead adopted neural fates. This is exactly the same phenotype obtained by inhibition of FGF signals. Conversely, when ephrin-Ad is knocked down by morpholino injection, the neural fate disappears and instead the neural precursors adopt notochord fate. Thus ephrin-Ad mediated signals acts in exactly the opposite way to FGF signals, suggesting that activation of ephrin/Eph signals can inhibit FGF/Ras/MEK/ ERK pathway. In order to directly adress this issue, we analysed the activation state of ERK1/2 in ephrin injected embryos… Première démonstration du rôle d’un ligand ephrin dans l’inhibition de la voie FGF et dans la spécification d’un type cellulaire « in embryo »

Clare Hudson Hitoyoshi Yasuo

Etudes fonctionnelles: transgénèse Jiang et al. (2005) Veeman et al. (2007)

d’après Imai et al. (2008)

Système nerveux CNS Epiderme Harafuji et al. (2002)

Etudes fonctionnelles: microinjection Injection d’ARN codant pour une protéine « taggée » Immuno-détection de la protéine développement (3hrs) injections d’ARN codant pour tous types de protéines (constructions fluo, dn, o/e simple) et oligo MO Aussi possible d’électroporer embryons, lignées transgéniques stables…. Toutes ces caractéristiques, et notamment la relative simplicité du génome et son séquençage, ont permis de mener des études à très grande échelle du développement de ces embryons (cribles HIS hight throughput, crible fonctionnels par knock down systématique de gènes, transgénèse…) stade 2 cellules stade 32 cellules

Manipulations embryologiques stade 8 cell. stade 16 cell. stade 32 cell. Embryons accessibles à manip d’embryologie classiques qui permettent par exemple étude d’inductions de types cellulaires par interactions cellulaires… Tiré du logiciel « 3D Virtual Embryo » v2.1 Tassy et Lemaire (2003)

Le lignage cellulaire neural notochorde Lignage cellulaire: Possibilité d’étudier la spécification de types cellulaires au niveau cellulaire dans un contexte embryonnaire (un peu à la frontière entre cultures cellulaires et embryologie…) Modèle ascidies= modèle phylogénétiquement proche des vertébrés+modèle « simple » qui autorise études fonctionnelles poussées. neural notochorde