Les méthodes séparatives: la chromatographie I- Introduction II- Chromatographie sur colonne : aspects généraux III- La chromatographie liquide haute performance (HPLC) III- La chromatographie en phase gazeuse (CPG) IV- La chromatographie d’exclusion stérique (SEC) V- Analyse quantitative 1 1

I- Introduction 1- Historique En 1906, un botaniste russe Mikhail Semenovich TSWETT (1872-1919) purifie des pigments végétaux, comme la chlorophylle, sur une colonne de craie. Il donne alors à ce phénomène de séparation le nom de chromatographie (du grec khrôma, couleur et graphein, écrire) qu’il définit comme l’enregistrement graphique des couleurs. On assiste alors à la naissance de la chromatographie. En 1952, les biochimistes A. J. P Martin et R. L. M. Synge reçoivent le prix Nobel de chimie pour leur contribution au développement de la chromatographie moderne. La chromatographie à connu un essor important durant ces 50 dernières années dont l’origine tient, dans une large mesure, au fait que se trouvent associés une méthode séparative rapide et performante couplée à des détecteurs sensibles et variés. Aujourd’hui chromatographie préparative chromatographie analytique 2 2

2- Définition : IUAPC (International Union of Pure and Applied Chemistry) La chromatographie est un procédé physico-chimique de séparation d’un mélange homogène liquide ou gazeux. Le principe repose sur l'équilibre de concentrations des composés présents entre deux phases en contact : la phase stationnaire et la phase mobile qui se déplace. La séparation est basée sur l'entraînement différentiel des constituants du mélange. La phase stationnaire est une phase qui reste en place, soit dans une colonne, soit sur une surface plane. La phase mobile est une phase qui se déplace sur ou à travers la phase stationnaire, entraînant l’analyte avec elle. L'élution est un processus au cours duquel les analytes sont entraînés à travers une phase stationnaire par le mouvement d’une phase mobile. 3 3

3- Classification Selon la technologie mise en œuvre Chromatographie sur colonne Chromatographie de surface :sur papier ou sur couche mince (CCM) Selon la nature des phases Selon la nature de la phase mobile on distingue: la chromatographie en phase liquide CPL la chromatographie en phase gazeuse CPG la chromatographie en phase supercritique CPS Selon la nature de la phase stationnaire on distingue: la chromatographie gaz / solide CGS la chromatographie gaz / liquide CGL la chromatographie liquide / solide CLS la chromatographie liquide / liquide CLL Selon la nature des phases phénomènes mis en jeu dans la séparation La chromatographie d’adsorption basée sur les processus répétés d’adsorption/désorption par la phase stationnaire (solide) La chromatographie de partage basée sur les différences de solubilité des molécules entre la phase stationnaire (liquide) et la phase mobile La chromatographie d’échange d’ions Échange entre une phase stationnaire ionisée et un soluté ionisé ou ionisable La chromatographie d’exclusion basée sur la séparation des molécules en fonction de leur taille La chromatographie d’affinité Il s’agit là d’une association entre une molécule polyfonctionnelle et une phase stationnaire comportant des sites stériquement définis et de capacité d’échange multiple 4 4

4- Les interactions. Les forces intermoléculaires Forces de dispersion de London - interaction entre dipôles instantanés - interaction présente dans tous les composés -n’intervient qu’à courte distance -augmentent avec la polarisabilité des molécules d+ d- Molécules apolaires

- attraction entre dipôles permanents Forces de Keesom - attraction entre dipôles permanents d- d+ Molécules polaires Forces de Debye - interaction entre dipôles permanents et dipôles instantanés ( ou induits )

XH l Y Liaison hydrogène : - attraction de type Keesom entre un H lié à un atome électronégatif et un autre atome électronégatif - interaction à plus longue distance X et Y = F, O ou N donneur accepteur XH l Y

Interactions ioniques Énergie de « liaison » Forces de London Forces de Debye Forces de Keesom Liaisons hydrogène Interactions ioniques

Ordre de polarité des molécules - Hydrocarbures R-H alcanes alcènes aromatiques - Composés halogénés R-X - Ethers ROR’ - Dérivés nitrés RNO2 - Esters RCOOR’ - Dérivés carbonylés aldéhydes RCHO cétones RCOR’ - Alcools ROH - Amines RNH2 - Dérivés d’acides carboxyliques amides RCONHR’ nitriles RCN acides RCOOH - Eau H2O

Interactions dipôle/dipôle Le partage des analytes est donc guidé par leurs interactions avec chacune des deux phases. Plus l'analyte interagit avec la phase stationnaire, plus son élution sera longue. Forces de dispersions Dipôle instantané/ dipôle instantané 0,5 à 10 kJ.mol-1 Toutes les molécules Interactions dipôle/dipôle Dipôle : permanent/permanent permanent/induit Molécules polaires Molécules possédant des e- p Liaisons hydrogène 8 à 40 kJ.mol-1 Molécules possédant des H labiles Interactions diélectriques 40 à 85 kJ.mol-1 Ions 6 10

II- Chromatographie sur colonne: aspects généraux Le processus chromatographique Le chromatogramme et les pics chromatographiques Les grandeurs fondamentales de la chromatographie La relation fondamentale 11 11

1- Le processus chromatographique La phase mobile est continuellement introduite sur la colonne L’échantillon est introduit sans arrêter le flux de phase mobile Les solutés se répartissent entre les deux phases Les composés sont élués en fonction de leur affinité vis-à-vis des phases Les solutés sont détectés en sortie de colonne par le détecteur (KA ≥ 1) 12 12

2- Le chromatogramme et les pics chromatographiques Le résultat de l’analyse est le chromatogramme (ensemble de pics) Le pic chromatographique représente la distribution statistique des temps de transit du composé dans la colonne : c’est une courbe de Gauss (en chromatographie idéale ) Moyenne : temps de rétention Variance ² : liée à l ’étalement de l ’arrivée des molécules Le temps de rétention est une grandeur qualitative :il est identique pour des conditions identiques L’aire ou la hauteur est une grandeur quantitative 13 13

W : largeur du pic à une ordonnée déterminée A la base A la mi-hauteur

Isothermes de distribution : A: situation idéale pic gaussien B : situation dans laquelle la phase stationnaire est saturée C : situation inverse dans laquelle le constituant est trop retenu dans la phase stationnaire Facteur de traînée : Ft = b/a A : Ft = 1 ; B : Ft > 1 ; C : Ft < 1

3- Les grandeurs de rétention Temps de rétention: Le temps de rétention tR: temps écoulé entre l’instant de l’injection et celui déterminé au maximum du pic Le temps mort tm (ou t0) : temps de rétention d’un composé non retenu par la colonne Le temps de rétention réduit tR’: différence entre temps de rétention et temps mort tR’ = tR - tm Expression du temps mort: Top d’injection temps Pic de l’air Pic de soluté t R m t’ Longueur Porosité Section Vitesse linéaire Débit 16 16

On démontre que : VR = VM + K VS Volumes de rétention: Le volume de rétention VR : volume de phase mobile nécessaire à l’élution du composé : VR = tR x D Le volume mort Vm : volume de phase mobile nécessaire à l’élution d’un composé non retenu par la colonne = volume de phase mobile dans la colonne = volume interstitiel accessible = VM VM = V0 = tm x D = t0 x D Le volume de rétention réduit : différence entre volume de rétention et volume mort VR’ = VR – VM On démontre que : VR = VM + K VS avec VS = volume de phase stationnaire Le temps de rétention dépend Du couple soluté-phase stationnaire en CPG Du triplet soluté-phase stationnaire-phase mobile en CL Du débit de la phase mobile De la masse de phase stationnaire dans la colonne De la température de la colonne De la longueur de la colonne Le temps de rétention ne dépend pas De la quantité de soluté injecté De la nature et de l ’abondance des autres constituants De la nature de la phase mobile en CPG

4- Les grandeurs de rétention relatives Facteur de rétention ou facteur de capacité k Il décrit la vitesse de progression d’un soluté dans la colonne une valeur de k élevée indique que le composé est fortement retenu par la colonne et qu’il passe un temps significatif à interagir avec la phase stationnaire Les chromatographistes essaient d’avoir des valeurs de k comprises entre 1 et 10 [soluté dans phase stationnaire] [soluté dans phase mobile] Volume de phase stationnaire Volume de phase mobile k est indépendant De faibles variations de débit Des dimensions de la colonne 18 18

Exercice d’application : Exprimer le temps d’analyse , assimilable au temps de rétention du composé le plus retenu en fonction de la longueur de colonne L , de la vitesse de la phase mobile u et des volumes de phase mobile VM et de phase stationnaire VS dans la colonne

5- L’efficacité : Nombre d’étages théoriques N Le nombre d’étages théoriques mesure la dispersion de l’analyse lors de sa traversée de la colonne Les équilibres sur la colonne - Analogie avec une colonne à distillée 64 mg de A K=1 5 équilibres 5 Plateaux 20 20

La hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT) N dépend De la nature de la colonne (capillaire ou remplie) De la qualité de la préparation de cette colonne De la façon dont elle est employée La hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT) L = longueur de la colonne

Equation de Van Deemter La théorie des plateaux néglige le passage continue de la phase mobile sur la phase stationnaire Ce passage produit un élargissement ou un rétrécissement des pics Giddings lie la HEPT à des paramètres qui dépendent de la vitesse de la phase mobile Equation de Van Deemter A = diffusion turbulente due à l’écoulement irrégulier de la phase mobile à travers la phase stationnaire (particules plus ou moins régulières) indépendant du débit ne dépend que des particules (  quand le diamètre  ) B = diffusion longitudinale, rend compte de la diffusion des molécules dans la direction de l’écoulement d’autant plus important que la vitesse est faible Dm coefficient de diffusion dans la phase mobile ;  tortuosité C = transfert de masse représente les inégalités de passage des molécules d’une phase à l’autre Toutes les molécules ne sont pas entraînées à la même vitesse Le contact entre phase mobile et phase stationnaire ne s’effectue pas partout de manière identique Le molécules de solutés dans la phase stationnaire sont situées à des distance variables de la phase mobile u = vitesse de la phase mobile , dépend de : La température La pression La colonne

6- Le facteur de sélectivité :  Décrit la position de 2 pics adjacents situés sur un chromatogramme. Il est toujours supérieur à 1.  représente la capacité qu’à une colonne à séparer chimiquement deux composés Équilibre CS  CM   > 1 24 24

7- Le facteur de résolution Rs Donne la mesure quantitative de l’aptitude d’une colonne à séparer deux solutés :largeur du pic à la base 25 25

Exercice d’application : Exprimer Rs en fonction des largeurs des pics à mi-hauteur 

8- Relation fondamentale Relation de PURNELL Terme cinétique Terme thermodynamique Relation d’approximation 27 27

Exercice d’application : A ) Montrer que l’expression de Purnell est équivalente à celle de la définition chromatographique de Rs lorsque les 2 pics ont des largeurs égales (w1 = w2 )

B ) Montrer que la relation d’approximation est équivalente à celle de la définition chromatographique de Rs lorsque les 2 pics ont des efficacités égales (N1 = N2 )