Apport de la Génomique fonctionnelle chez la Drosophile Etude de gènes humains impliqués dans des maladies.

What is Functional Genomics? Functional genomics refers to the development and application of global (genome-wide or system-wide) experimental approaches to assess gene function by making use of the information and reagents provided by structural genomics. It is characterized by high-throughput or large-scale experimental methodologies combined with statistical or computational analysis of the results (Hieter and Boguski 1997) Functional genomics as a means of assessing phenotype differs from more classical approaches primarily with respect to the scale and automation of biological investigations. A classical investigation of gene expression might examine how the expression of a single gene varies with the development of an organism in vivo. Modern functional genomics approaches, however, would examine how 1,000 to 10,000 genes are expressed as a function of development. (UCDavis Genome Center)

Completion of genome sequence projects marks the start of genome-based biology How can genome information be exploited ? Genes Genome structure Genome data Biochemical Biological What genes do Function Understanding expression and function in development and differentiation How genes work together Understanding expression and function in disease How genes can be used Diagnostics Therapeutics

Genome based approaches to function - Functional Genomics *DNA Microarrays - genome wide expression analysis of genes - Transcriptome *Proteomics - defining proteins, their functions and interactions - Proteome *Gene inactivation - defining function through gene silencing *Phenotype analysis - defining function through gene mutagenesis - Phenome

Le système biologique Drosophila melanogaster La mouche « a ventre noir » « qui aime la rosée »

Les avantages du système: - Cycle de vie court - Développement externe - Création et Entretien des stocks peu onéreux - Génome séquencé - Séquence du génome de 6 autres espèces : Agencourt Bioscience project (2004) : D. ananassae, D. erecta, D.grimshawi, D. mojavensis and D. virilis. TIGR (2004) : D. willistoni - Génétiquement manipulable - Génétiquement modifiable

Le génome de Drosophila melanogaster

180Mb dont 120Mb d’ euchromatine 4 Chromosomes

Génomes comparés Caractéristiques des génomes de levure, nématode, drosophile et de l'homme :   Levure S. cerevisiae Nématode C.elegans Drosophile Homme taille physique (Mb) 13 100 180 3.000 nombre de gènes 6.200 19.100 13.600 ~30.000 taille des gènes (kb) 1,4 2,7 3 28 fréquence des gènes (par kb) 2 4,8 / 6 9 ~100 teneur en [G+C] 38% 36% nd 41% fraction codante 68% 27% 13% 1,4% nombre moyen d'exons par gène 1,04 5,5 4,6 8,7 taille moyenne des exons (pb) 1.450 218 150 145 taille moyenne des introns (pb) 500 267 487 ~3.300

GeneMark.hmm, HMMgene, Eugene, GENIE, etc... Annotation du génome : Identifier tous les gènes dans un génome Mise au point de programmes automatiques : Approche conceptuelle basée sur des études linguistiques des séquences d’ADN On connait (partiellement) la syntaxe et la grammaire: utilisation de modèles de Markov cachés qui, après apprentissage sur un organisme donné, vont différencier les régions géniques des régions intergéniques Programmes adaptés aux génomes procaryotes et donnant de bon résultats pour les génomes eucaryotes possédant très peu d’introns (Levure) GeneMark, GLIMMER Programmes adaptés aux génomes eucaryotes présentant une forte proportion d’introns GeneMark.hmm, HMMgene, Eugene, GENIE, etc... Utilisés en conjonction avec des algorithmes neuronaux déterminant le départ de transcription (qui n’est pas toujours un ATG) Netstart les sites d’épissage Netgene2, SpliceNet, etc...

Annotation du génome Efficacité de ces programmes automatiques : excellente chez les procaryotes (rendement de 98-99%) chez les eucaryotes complexes : Les règles régissant la structure et l’organisation des gènes eucaryotes sont plus complexe! Mauvaise identification des gènes annotés : gènes interprétés comme deux gènes voisins deux gènes voisins interprétés comme un seul gène Une étude et exhaustive de réannotation manuelle du génome de la drosophile révèle aussi une mauvaise identification des gènes (Janvier 2003)

Annotation du génome Janvier 2003 : réannotation manuelle du génome de la drosophile……….. Nombre de gènes: quasi inchangé : 13601 (en 2000)-> 13676 (en 2003) 727 gènes trouvés par l’ancien programme GENIE erronés ont disparus 802 gènes trouvés par nouveau progamme GenScan ajoutés Structure de 85% des gènes modifiée: 1531 gènes initialement indépendants sont fusionnés en 602 nouveaux gènes 322 gènes morcelès en 675 nouveaux gènes 93 gènes réinterprétés complètement avec des mélanges de fusion et morcellement

Le nombre total de gènes identifiés ne reflète pas le niveau de complexité des organismes étudiés Estimation du Nombre de protéines codées par un gène ? Promoteurs Alternatifs: Nématode : 4 gènes codent 4 myosines différentes Drosophile : 1 seul gène code les 7 myosines connues Promoteur alternatif 13% des gènes (estimation Janvier 2003) Epissage Alternatif détermine une très grande partie de la diversité du protéome Drosophile : DSCAM (connection neuronale) / 1 orthologue chez l’homme 95 exons alternatifs 38016 protéines potentielles 48 / 50 clones cDNA identifiés sont différents Homme: 85% du protéome humain est déterminé par l’épissage alternatif Chrom 19 : 544 genes 1859 mRNAs en moy. 3.2 variant/gene Nématode: 9516 genes 12816 mRNAs en moy 1.34 variant /gene Polyadénylation alternative 6% des gènes de Drosophile (Janvier 2003) La diversité du protéome est le reflet la complexité d’un organisme.

Le nombre total de gènes identifiés ne reflète pas le niveau de complexité des organismes étudiés ….. on ne sait pas estimer l’état d’expression d’un gène : Information essentielle chez les organismes complexes où l’évolution se fait par la modulation de l’expression plus que par l'augmentation du nombre de gènes Les jeux de protéines synthétisées vont être très différents d'un tissu à l'autre d’un instant t à un autre.

Comparaison des génomes eucaryotes séquencés

The Biological Core or Core Proteome Human 35000 10000 Core proteome = nombre de familles de protéines distinctes codées par le génome d’un organisme donné. Les gènes paralogues (gènes équivalents dans une même espèce) sont comptés comme 1 Unité. Core proteome de la Drosophile est seulement 2 fois plus grand que celui de la Levure. Core proteome de la Drosophile et du Nématode de taille similaire malgré de grandes différences en terme de développement et morphologie. Le Core proteome est constitué de gènes jouant un rôle essentiel dans tous les aspects du fonctionnement cellulaire. Il semble que la majorité sinon tous les gènes du Core Protéome humain existent chez la drosophile.

Comparaison protéomes prédits : Homme , Drosophile, Nématode et Levure Nombre de groupes de protéines : Homme 3129 Fly 1445 Worm 1503 Yeast 1441 Fonctions cellulaires de base : Métabolisme, traduction, Réplication –réparation de l’ADN 1308 groupes de protéines contenant au moins 1 orthologue prédit dans chaque organisme (plusieurs groupes contiennent des paralogues)

- 504/1308 groupes de protéines contenant 1 orthologue prédit dans chaque organisme et 0 paralogues: Classement par catégories fonctionnelles Fonctions Clés n’ayant pas subit de duplication ni d’élaboration dans les différents lignages Ex : enzyme chaine respiratoire biosynthèse nucléotides Levure (unicellulaire): 0 dans cell communication 0 dans défense immunity

Comparaison protéomes prédits : Drosophile, Nématode et Levure Core protéome : Drosophile 8065 , Nématode: 9453 , Levure 4383 Comparaison par alignement de séquences: BLAST P et alignement d’au moins 80% de la longueur de la protéine de drosophile avec une autre séquence >>>sous estimation !!!

20% des protéines de drosophile ont un orthologue putatif chez le nématode et la levure Protéines impliquées dans des processus communs aux eucaryotes: réplication, transcription, traduction, division cellulaire… - 35% des gènes de drosophile ont un orthologue putatif chez le nématode -Développement des organismes pluricellulaires -Interactions cellule- cellule / cellule substrat -Protéines à homéodomaines, -Molécules d ’adhérence cellulaire…... - certaines familles de protéines sont présentes seulement chez la drosophile -Protéines impliquées dans la réponse immunitaire système immunitaire inné primitif similaire à celui des vertébrés -Protéines transmembranaires de fonctions inconnues -Protéines spécifiques (ex : cuticule)

Comparaison protéomes prédits :Homme , Drosophile, Nématode et Levure Génome humain : 3200 Mb, ~30 000 gènes prédits 2 duplications successives d ’un génome élémentaire non redondant (drosophile) Conservation au niveau moléculaire des produits de gènes entre Drosophile et Homme 67% homologie avec protéome de drosophile des produits de gènes entre Drosophile et nematode et levure 43% homologie avec protéome du nématode et de la levure 46% homologie avec protéome de la levure Gènes absents chez la drosophile/ homme: reflète différences physiologiques entre homme et drosophile: hémoglobines (thalassémies) réarrangement des gènes d’immunoglobuline (système immunitaire acquis)

The Berkeley Drosophila Genome Project (BDGP): ‘The fly is an extremely useful model system for studying genes associated with disease in humans.’ The Berkeley Drosophila Genome Project (BDGP): > 60% (177/289) de gènes humains impliqués dans des pathologies humaines ont des homologues évidents chez la drosophile.

‘The fly is an extremely useful model system for studying genes associated with disease in humans.’ 289 human proteins used as queries to search a database consisting of the sum total of gene products (38,860) found in the complete genomes of fly, worm, and yeast. BLASTP searches TBLASTN searches : control for potential frameshift errors in the Drosophila genome sequence. Only two cases were manually corrected. Results are scaled according to various levels of statistical significance, Refelect the level of confidence in either evolutionary homology or functional similarity. « + » : likely functional equivalent of the human protein (biological evidence) « - » unable to identify a likely functional equivalent of the human protein. < < < no or weak sequence similarity E values >1 X 10–6 highest degree of sequence conservation. E values < 1 x 10-100

BDGP

BDGP

~76%(548/714) of the human disease genes had homologues in the fly ‘The fly is an extremely useful model system for studying genes associated with disease in humans.’ E. Bier. University of California San Diego : 714 Human genes from OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) versus Drosophila genome BLASTP , E value of 10-10 ~76%(548/714) of the human disease genes had homologues in the fly E. Fortini .University of Pennsylvania School of Medicine : 287 other Human genes from OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) 62 % (178/287) of the human disease genes had homologues in the fly « Homophila is an ongoing project whose ultimate goal is to facilitate communication between fly and human researchers. »

Analyse de la fonction de gènes humains dans le système modèle drosophile Transgenèse : élément transposable P , sytème UAS –GAL4 Expression dirigée d’une protéine humaine in vivo chez la drosophile grâce au système UAS-GAL4: - Interactions entre protéine humaine et protéine(s) endogène(s) - Perturbation d’une (de) voie(s) biologiques «normales - Apparition d’un phénotype Analyse du phénotype : Microscopie, Microscopie Electronique, Immunodétection, Transcriptome Recherche de modificateurs (interaction) Crible génétique pour des mutations second-site (« random ») ou Utilisation résultats du transcriptome (« targeted »)

TRANSGENESE Utilisation d ’un élément transposable (élément P), pour introduire de façon stable et héritable un transgène dans le génome. cDNA X miniwhite Plasmid sequences Promoteur minimum transposase Gène X Origine de réplication Gène de résistance (i.e. AmpR) Pieds (5’et 3’) de l’élément P Gène marqueur de la transgénèse: mini w Clonage

TRANSGENESE Generation of transgenic fruit flies by P-element transformation. The P element, a mobile genetic element, can move from one place in the genome to another. This movement (transposition) is catalyzed by transposase, which is encoded by the P element; the 3′ and 5′ ends of the P element are recognized by transposase and are required for transposition to occur. To produce transgenic fruit flies by this method, the functionally different regions of the P element are incorporated into two different bacterial plasmids. The donor plasmid contains three necessary elements: the transgene (orange); a marker gene (green) used to indicate flies in which the plasmid DNA is transposed to a recipient chromosome; and both ends of the P element (dark purple) — 3′ P and 5′ P — flanking the other two genes. It does not contain transposase. In this example, the marker is the dominant w+ allele, which confers red eye color. The red bracket indicates the segment of the donor plasmid that can transpose into the fly genome. The other plasmid carries the P element (encoding transposase) with mutations in one end, which prevent it from transposing. The two plasmids are co-injected into blastoderm embryos homozygous for the recessive w− allele, which confers white eye color. Transposase synthesized from the gene on the P-element plasmid catalyzes transposition of the donor plasmid DNA into the fly genome. Because transposition occurs only in germ-line cells (not in somatic cells), all the G0 adults that develop from injected embryos have white eyes. Mating of these flies with white-eyed flies will yield some G1 red-eyed progeny carrying the transgene and the marker allele (w+) in all cells.

----------------------> Système UAS GAL4 : expression conditionnelle et tissu-spécifique Gal4 ----------------------> ARNm Gal4 Protéine Gal4 Gène X ----------------------> mRNA X Protéine X Activating line DRIVER-GAL4 Responder line: UAS- GeneX DRIVER-GAL4 : Embryo , Larva, Adult Eye Wing Muscles Nervous System Ovary, testis……….. UAS-GENE X (UAS-cDNA) Drosophila heterologous : human OVEREXPRESSION UAS-dsRNA RNA interference LOSS OF FUNCTION DRIVER-GAL4 UAS-GeneX

préséniline (Maladie d’ALZHEIMER) Analyse de la fonction de gènes humains dans le système modèle drosophile Sur-expression de gènes homologues à des gènes humains dans les disques imaginaux précusseurs de l’aile Exemple de gènes humains impliqués dans des maladies neurodégénératives : préséniline (Maladie d’ALZHEIMER) Ye & Forte, 1999. J.Cell. Biol. 146:1351

Sur-expression de gènes homologues à des gènes humains dans les disques imaginaux précusseurs de l’œil Exemple de gènes humains impliqués dans des maladies neurodégénératives : ataxine 3 Maladie de Machado-Joseph ; Ataxie spinale-cérébelleuse type 3 -Expression d’une protéine normale (27 glutamines) et mutante (78 glutamines) -Phénotype: Oeil rugueux , Défauts de pigmentation, Inclusions nucléaires - Recherche de modificateur : Phénotype corrigé par la sur-expression de hsp70 (chaperone) N.M Bonini, Parkinsonism and Related Disorders 7 (2000) 171-175)

Mais l’existence de l’homologue drosophile du gène humain n’est pas forcément requise…. Sur-expression d’un gène humain impliqué dans une maladie neurodégénérative et ne possédant pas d’homologue drosophile dans le système nerveux de la mouche Exemple: gène a-synucléine Maladie de Parkinson (N.M Bonini / Parkinsonism and related disorders 7 (2001) 171-175) Expression d’ a-synucléine sauvage et mutantes Phénotype : défaut de locomotion Aggravation du phénotype avec l’âge Présence de Corps de Lewy (neurones DOPA)

Study of genes involved in cardiomyopathies : Mais l’existence de l’homologue drosophile du gène humain n’est pas forcément requise…. IBDML- Michel Piovant Study of genes involved in cardiomyopathies :

t gène MYBPC3 cardiac Myosin Binding Protein C Mais l’existence de l’homologue drosophile du gène humain n’est pas forcément requise…. Study of genes involved in hypertrophic cardiomyopathies : t gène MYBPC3 cardiac Myosin Binding Protein C Myosin/Titin binding Myosin binding Actin binding C0 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 MyBPC motif and phosphorylation site Ig Fn Projectin 6x cMyBP-C No c MyBP-C drosophila homolog

Drosophila model to approach human gene function AIM: t Identify the primary events associated with human mutated proteins. l Remodelling gene expression programs HOW: t Create transgenic flies allowing gene overexpression or inactivation in a specific tissue: l Indirect Flight Muscles, dorsal vessel t Analyze the global changes in gene expression profiles using DNA microarrays: l Manufacture cDNA Nylon microarrays, l Evaluate transcriptome variations, l Provide a biological explanation, l In vivo validation.

1. Create transgenic flies expressing cMyBP-C in Indirect Flight Muscles Myosin Myosin/Titin Actin WTt C0 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 M6t M0t Activating line IFM : SG29.1-GAL4 Responder lines UAS-cMyBPC SG29.1-GAL4 UAS-cMyBPC Human protein expression site : Indirect Flight Muscles (IFM) Fly vs vertebrate striated muscles t Development and structure highly conserved t Organization of the Sarcomere conserved IFM and vertebrate cardiac muscle: t Asynchronous muscles t Stretch activation response

EFFECTS OF HUMAN PROTEIN EXPRESSION IN DROSOPHILA IFM:

Transgenic cMyBP-C protein incorporates the Z-I region of the IFM sarcomere. Kettin cMyBP-C merge

Structural abnormalities of Transgenic IFM vs WT IFM sarcomere t Reduction of sarcomere length ( -10% ) t Fragilization fibers at the level of the Z band SG29.1 -GAL4 M0t cMyBPC

Expression of cMyBP-C in IFM leads to an age and dose dependent flightless phenotype

Manufactured Drosophila cDNA nylon microarrays 3600 genes 2. Analyze the global changes in gene expression profiles using DNA microarrays Manufactured Drosophila cDNA nylon microarrays 3600 genes PROBES PCR amplification products 6000 cDNA clones (0,15 - 8,0 kb; 42% genome; Drosophila genome : 13 666 predicted genes) « 3574 Nylon microarray » COMPLEX TARGET 0.5 -1µg total RNA reverse transcription (oligo dT primed) 33P labelling Spotting onto Nylon GMS 427 arrayer Hybridization: 1. Oligo-vector - Reproducibility of microarrays - Oligovector correction: Intra-membrane comparison Complex Target - WT IFM total RNA - MO cMyBP-C IFM total RNA 3 hybridizations / complex target cDNA Oligo-vector 20 mers

M0t cMyBP-C IFM versus non transgenic control IFM 2. Analyze the global changes in gene expression profiles using DNA microarrays M0t cMyBP-C IFM versus non transgenic control IFM 8 day old adult flies. 97 genes are transcriptionally deregulated: DOWN 64 genes (46 known). UP 33 genes (21 known). What are the biological processes affected by the expression of human cMyBPC in the Drosophila flight muscle?

Example of genes differentially expressed in 8-day-old M0t transgenic IFM versus non transgenic IFM. Genome « 3574 Filter » DOWN UP Muscle fiber 13 5 5 0 Actin Binding 105 29 3 0 Tropomyosin binding 3 3 3 0 Chaperones 37 12 4 0

Example of genes differentially expressed in 8-day-old M0 transgenic IFM versus non transgenic IFM.

3. Genetic evaluation of candidate modifiers : Calmodulin in vivo validation Lowering Calmodulin expression in transgenic flies expressing cMyBP-C induced an age dependant suppression of the flightless phenotype .

Interprétation des variations d’expression Création d’un outil bioinformatique Fly Genome Explorer Thien Phong Vu Manh, Michel Piovant and Laurence Röder Collaboration with DESS trainees Magalie Celton (Evry) Benoît Chauvin (Strasbourg)

http://www.fruitfly.org/

all genes Quick search : tsh teashirt tin tinman wg wingless ace Format with images Basic search: Ex : Body part