CXCR4 et Gab1 coopèrent pour contrôler le développement des cellules progénitrices des muscles migrantes Elena Vasyutina Accepté le 13 juillet 2005

Bibliographie Dermomyotome = origine des muscles squelettiques d’embryon de vertébrés. Cellules ventrales du dermomyotome => perte morphologie épithéliale => délamination => migration. Formation cellules progénitrices => muscles hypaxial des extrémités, la langue et le diaphragme. Nombreux gènes essentiels pour le développement des progéniteurs migrants hypaxial : Pax3 requis pour l’établissement correct d’un pool de progéniteurs dans le dermomyotome ventral. Récepteurs tyrosine kinase c-Met + ligands essentiels pour délamination des progéniteurs qui sont destinés à migrer. Gab1 code pour une molécule adaptatrice qui transmet le signal c-Met. Lbx1 code pour un facteur de transcription à homédomaine, qui est exprimé exclusivement dans les progéniteurs migrants qui forment les muscles hypaxial. Inactivation de Lbx1 altèrent la migration des progéniteurs en migration tandis que les autres populations de cellules musculaires trouvent leur cible. => Les différents sous populations de cellules progénitrices de muscles rencontrent et répondent à des sélections distinctes durant la migration.

Bibliographie (2) Cellules qui ont trouvé leur cible => prolifération => expression des facteurs régulateurs myogéniques (MyoD, Myf5, la myogénine et MRF4) => programme de différenciation. Récepteurs aux chimiokines + ligands régulent la migration des cellules. SDF1 = ligand du récepteur CXCR4. Mutants CXCR4 ou SDF1 de souris => Problème migration des cellules. Sites préférentiels dans la métastase du cancer du sein de la femme corrélés avec l’expression de CXCR4 dans les cellules tumorales et avec l’expression de SDF1 dans les organes envahit par les cellules métastasées. => Fonction possible de CXCR4/SDF1 dans les cellules musculaires.

But => Détermination des gènes impliqués dans la migration des cellules progénitrices des muscles, lors du développement chez l’embryon de poussin et souris. Expériences réalisées : Détermination du profil d’expression des gènes Lbx1, CXCR4 et SDF1 dans des embryons de poulet et de souris, à différents stades de développement. Effets de SDF1 sur les cellules progéntrices de muscles. Distribution spatiale de CXCR4 dans les bourgeons musculaires.

Résultats

L’allèle Lbx1GFP permet le tri des cellules progénitrices de muscles par le profil d’expression des gènes. Création du mutant Lbx1GFP : Lbx1 exprimé durant le développement d’une large gamme des cellules migrantes hypaxial, mais non dans les autres types de cellules progénitrices de muscles. Pour isoler des progéniteurs de muscles par tri de cellules => génération d’un mutant de l’allèle Lbx1 fusionné à la GFP par recombinaison homologue dans des cellules ES (Fig A). Sélection des cellules Lbx1GFP => Southern blot (Fig B).

L’allèle Lbx1GFP permet le tri des cellules progénitrices de muscles par le profil d’expression des gènes (2). Protéine GFP produite par l’allèle Lbx1GFP localisée dans les cellules migrantes progénitrices du muscle au niveau dorsale et ventral des membres (Fig C). Anti-Lbx1 en rouge. Anti-GFP en vert.

L’allèle Lbx1GFP permet le tri des cellules progénitrices de muscles par le profil d’expression des gènes (3). Profil d’expression des gènes dans les cellules Lbx1GFP : Des cellules progénitrices de muscles GFP+ ont été isolé au niveau de bourgeons de membres. Membres antérieurs d’embryon de stade 10.5 jours ont été disséqué, les cellules ont été dissocié, et les cellules GFP+ ont été isolé par cytométrie de flux. Sondes générées par de l’ARN obtenu de ces cellules et utilisées pour l’hybridation Affymetrix GeneChips. Technique Affymetrix GeneChips Utilisation de micropuces sur lesquelles on dépose des séquence d’ADN qui vont représenter l’ensemble du génome des cellules que l’on étudie. Les sondes générées permettront de voir directement sur les puces les gènes qui sont actifs ou réprimés dans le type cellulaire étudié.

L’allèle Lbx1GFP permet le tri des cellules progénitrices de muscles par le profil d’expression des gènes (3). Profil d’expression des gènes dans les cellules Lbx1GFP : Des cellules progénitrices de muscles GFP+ ont été isolé au niveau de bourgeons de membres. Membres antérieurs d’embryon de stade 10.5 jours ont été disséqué, les cellules ont été dissocié, et les cellules GFP+ ont été isolé par cytométrie de flux. Sondes générées par de l’ARN obtenu de ces cellules et utilisées pour l’hybridation Affymetrix GeneChips. Technique Affymetrix GeneChips Utilisation de micropuces sur lesquelles on dépose des séquence d’ADN qui vont représenter l’ensemble du génome des cellules que l’on étudie. Les sondes générées permettront de voir directement sur les puces les gènes qui sont actifs ou réprimés dans le type cellulaire étudié.

Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin. Expériences réalisées des techniques d’hybridation in situ et d’immunohistochimie. CXCR4 exprimé dans les bourgeons des membres (Fig A,C,E). Distribution de l’expression de CXCR4 similaire à celle de Pax3 ou de Lbx1 mais non identique dans les cellules progénitrices des muscles. Jet de cellules CXCR4+ observé le long de la chorde hypoglossal et dans l’arc primaire branchial, le long de la route et au niveau de la cible des cellules progénitrices migrantes des muscles qui génèrent le muscle intrinsèque de la langue (Fig G). Anti CXCR4 en rouge Anti Lbx1 en vert

Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin (2). L’expression de SDF1 peut être détecté dans les membres en bourgeon du mésenchyme, et le schéma d’expression est identique au cours du développement (Fig B,D, F). Quand les cellules progénitrices des muscles se délaminent => SDF1 exprimé dans le bourgeon proximal des membres (Fig B,D). Après que les cellules soient entrées dans les membres, l’expression de SDF1 est aussi observée plus étalée dans le mésenchyme (Fig F) => Les cellules migrantes progénitrices de muscles, dans les muscles, sont trouvées à la proximité des cellules exprimant SDF1. Comparaison d’un contrôle et d’embryons Lbx1 -/- => schémas d’expression similaire pour SDF1 => progéniteurs de muscles n’expriment pas SDF1.

Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin (3). Analyse de la distribution de Lbx1 et CXCR4 par immunohistochimie, pour identifier si CXCR4 et Lbx1 sont exprimés dans les mêmes populations de cellules. Cellules CXCR4+ dans les masses de pré-muscles des membres, sont aussi Lbx1+ => CXCR4 est présent dans les cellules migrantes progénitrices (Fig D). Cependant, pas toutes les cellules Lbx1+ expriment CXCR4 !

Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin (4). Lbx1 apparaît dans les progéniteurs précédant leur délamination du dermomyotome ventral (Fig A). CXCR4 et Lbx1 co-exprimés après que les cellules migrantes progénitrices aient migré en dehors du dermomyotome (Fig A). Protéine CXCR4 présente dans les cellules qui sont déjà entré dans le membre antérieur au stade 10.0 à 10.25 jours, mais localisée seulement dans une sous-population de cellules Lbx1+ qui sont localisées près de l’ectoderme (Fig A,B,C). Entre les stades 10.25 et 11, le nombre de cellules CXCR4+ augmentent, mais un nombre signifiant de cellules Lbx1+ restent négatives pour CXCR4 (Fig B,C).

Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin (5). Toutes les cellules Pax3+ dans les membres co-expriment Lbx1. Des cellules Pax3+/CXCR4+ et Pax3+/CXCR4- existent dans les membres. Schémas de l’hybridation in situ de CXCR4 et Pax3 similaires mais non identiques => toutes les cellules Pax3+ n’expriment pas CXCR4.

Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin (6). Examination de CXCR4 et MyoD par immunohistologie => populations de cellules CXCR4+ et MyoD+ distinctes (Fig E,F). Cellules MyoD+/Lbx1+ ou MyoD+/Pax3+ sont fréquemment détectées. Dans membres développés, cellules CXCR4+ placées plus près de l’ectoderme que les cellules MyoD+. =>Les progéniteurs migrants des muscles n’expriment pas CXCR4 au moment où ils sont dans le dermomyotome. Cellules CXCR4+ co-expriment Lbx1 et Pax3, c’est à dire, les protéines connues pour être exprimées dans les progéniteurs migrants, mais non le facteur de différenciation musculaire MyoD. => Ainsi, CXCR4 est régulé négativement dans les progéniteurs de muscle primaires pour leur différenciation (Fig 3G).

Expression de CXCR4 et SDF1 chez la souris et le poussin (7). Représentation de l’expression des gènes dans les cellules progénitrices des muscles durant le développement

Les cellules CXCR4 répondent-elles à SDF1? Western blot Vérifie que les protéines SDF1 ont été exprimé par le plasmide et non par la cellule Cos1

Application de SDF1 aux positions ectopiques dans le membre de poussin Révélation par hybridation in situ Accumulation de CXCR4 près de l’implant

Par hybridation in situ avec une sonde Pax3 Redistribution substantielle des cellules progénitrices des muscles

Redistribution plus prononcée de CXCR4 par rapport à Pax3 Certaines cellules de Pax3 n’ont pas répondu à SDF1 SDF1 attire les cellules CXCR4

Effet de SDF1 sur la différenciation Signaux d’hybridation inférieur

conclusion SDF1 attire seulement des cellules CXCR4, cellules progénitrices des muscles. SDF1 supprime leur différenciation

Distribution des cellules hypaxiales Les outils nécessaires: un allèle muté de CXCR4, noté CXCR4-/- et Gab1, noté Gab1-/- Anticorps anti-Lbx1 et anti-MyoD ( pour visualiser les populations de cellules)

Hypoglossal cord Diminution de Lbx1 et MyoD contrôle

Dans les cellules doubles mutants, les cellules Lbx1 n’atteignent pas Le nombre de Lbx1, MyoD est inférieur du contrôle Lbx1, MyoD ne sont pas discernable Dans les cellules doubles mutants, les cellules Lbx1 n’atteignent pas leur cibles

Il est impossible de compter des cellules quantification Membres diviser en 4 domaines : I = domaine dorsal proximal II = domaine dorsal distal III = domaine ventral proximal IV = domaine ventral distal

Diminution de nombre de Lbx1 Diminution du nombre de MyoD plus importante dans le domaine dorsal distal par rapport au domaine dorsal proximal

Ils ont compté tous les noyaux apoptotique Augmentation significative d’apoptosis dans le domaine dorsal proximal dans les cellules mutants Les cellules progénitrices des muscles ne sont pas correctement distribuées et leur survie est altérée dans le domaine I dans les embryons mutés

Analyse de l’effet de CXCR4 mutant dans Gab1 Les cellules Lbx1 et de MyoD ont diminué

Analyse de la mort cellulaire Le nombre de cellules apoptotique augmentent dans le domaine I

La génération d’un muscle Comparaison du muscle de la langue et du membre de contrôle Anticorps anti-myosine et anti-MyoD Muscle intrinsèque Muscle extrinsèque

Muscle intrinsèque Partie distal Partie proximal Dérive du mésenchyme Partie distal Dérive des somites occipital

Aucune différence

différence -Un fragment du muscle intrinsèque dans le domaine proximal -la taille globale est petite Le muscle intrinsèque est petit mais observable

conclusion Simple mutant CXCR4 Aucune différence dans le développement de la langue Cellules Lbx1 et MyoD Diminution modérée Double mutant Un fragment du muscle intrinsèque et une langue petite Diminution importante des cellules Lbx1 et MyoD

La réduction modérée des cellules Lbx1, aux étapes dévéloppementales préliminaires a été plus tard compensée et n’a pas affecté la taille finale de la langue (CXCR4-/-) La réduction importante du nombre de cellules Lbx1 a affecté le développement du muscle de la langue Les mécanismes compensateurs fonctionnent seulement pour un seuil de cellule Lbx1 atteint

Discussion La protéine CXCR4 est présente après délamination du dermomyotome et elles sont observé une fois que les cellules ont atteint le membre antérieur Expression de CXCR4 est observé après l’expression de Pax3 et de Lbx1

Lbx1 pourrait participe au contrôle d’expression de CXCR4 Souris mutant Lbx1 pas expression de CXCR4 au niveau des membres Lbx1 pourrait participe au contrôle d’expression de CXCR4 CXCR4 est exclusivement exprimé dans les cellules n’exprimant pas MyoD CXCR4 est exprimé pendant la migration cellulaire

L’application ectopique de SDF1 à démontré que les cellules Pax3+ et de CXCR4+ émigrent vers la ‘‘source’’ de SDF1 (redistribution de CXCR4 + importante que Pax3) Mutation de CXCR4 montre un changement de la distribution des cellules avec une de Lbx1 dans le membre distal alors que dans le membre proximal, les cellules apoptotique sont + importante (membre distal pas détectable)  Hyp: il faudrait plusieurs facteurs simple pour guider la migration

Souris simple mutante Gab1, le nombre de cellules progénitrices des muscles est réduit / WT mais atteignent la 1er voûte branchial et le membre antérieur Souris double mutante, les cellules n’atteignent pas la 1er voûte bronchial Conséquence: déficit grave du muscle de la langue Souris simple mutante CXCR4, pas de changement reproductible de la langue Simple mutant, la réduction est compensée dans les étapes suivantes

La compensation est possible seulement pour un seuil de cellules Les mécanismes compensatoires pourraient prolonger la phase de prolifération des cellules progénitrices aux étapes suivantes La compensation est possible seulement pour un seuil de cellules atteint Le nombre critique correspondrait environ à la moitié du nombre de cellules progénitrices des muscles présent dans le membre WT

Les récepteurs tyrosine kinase et chemokine sont des molécules importante dans la migration des cellules et peuvent affecter la mort cellulaire Les deux mutations affectent la distribution et la survie des cellules progénitrices des muscles, avec un degré différent On parle d’interaction génétique entre les deux lignée

Stimulation des cascades de phosphorylation des tyrosines La signalisation de Gab1 et de CXCR4 contrôle la polymérisation d’actine et l’attachement à la matrice La phosphorylation des tyrosines sur Gab1 voie de signalisation qui régulent la mobilité, la prolifération et la survie des cellules Les récepteurs chemokine emploient la protéine G pour transmettre des signaux Stimulation des cascades de phosphorylation des tyrosines +

L’interaction génétique que nous observons pour Gab1 et CXCR4 pourrait refléter le fait que les cascades de transduction de signal utilisé par ces molécules convergent sur des effecteurs identiques à la migration de contrôle et à la survie des cellules progénitrices de muscles