Déterminisme du Sexe et la compensation de dose chez la souris

Gametogenèse, compensation de dose, empreintes génomiques, souris mutantes-t,déterminisme de sexe

Le sexe est déterminé par le gonade XX:développement des ovairessystème Mullerianorganes génitaux femelle XY:développement des testiculesSystème Wolffianorganes génitaux mâle Enlève les gonades avant que le sexe soit déterminé: -chez les souris XX et XY développement du système Mullerian Greffe d’un testicule à coté d’une ovaire à 12 jours: -Wolffian développe et le Mullerian disparaît. Donc: L’ovaire n’est pas essentiel pour le développement du système Mullerian -Le testicule est essentiel pour le développement du Système Wolffian -Le testicule produit une molécule qui inhibe le développement du système Mullerian

Développement mâle et femelle

Zfy et Sxr A Oxford en 1971 ils ont trouvé une souris sex-reversed: Sxr XX mais mâle à cause d’une translocation Cherchez dans cette région pour le gène commutateur Page et al: ont trouvé un gène Zfy -zinc finger facteur de transcription Par Southern blot ils ont détecté deux bandes: une séquence sur le chromosome X et l’autre sur le chromosome Y???? 3 explications: -allèles X et Y sont des sous-unités d’une protéine -allèle X est non fonctionnel -inactivation du chromosome X chez la femelle donne un seul allèle actif chez le femelle, deux chez la mâle BUT: Zfy n’est pas exprimé dans les testicules des souris Steel…donc c’est pas le bon candidat.

Quels sont les cibles de Sry Sry se fixent sur une séquence de 6/7 nucléotides ( AACAAT oligonucléotide sélection). Cherchez des gènes qui s’expriment après Sry et où la séquence de 6/7 nucléotides est présente dans le promoteur. Sox 9 ( 20 gènes Sox chez la souris: important pendant le développement: SrybOX) Souris transgènique: Sry promoteur+myc. Regarde l’expression de la protéine MYC et l’expression de la protéine SOX9. MYC ensuite MYC+SOX9 ensuite SOX9 Conclusion: Sry gène est transcrit pour une période courte et la protéine SRY active le promoteur du gène SOX9. SOX9 peut changer le sexe d’une souris. SRY peut probablement activer le gène AMH ( anti-Mullerian hormone)  dégénération des structures femelles Sox3: inhibiteur du gène Sox9???

Expression de la protéine SRY

Régulation de l’expression du gène Sry WT1=Wilms Tumour Gene: +/- KTS ( +/- lysine threonine serine dans un des doigts à zinc qui se fixe sur l’ADN)

Sry/SRY murine et humain Peu de conservation en dehors de la boîte HMG Murine protéine tronquée ne fonctionne plus Protéine humaine fonctionne chez la souris L’activité de SRY dépend de son état de phosphorylation?

Un gène pour le développement femelle? La majorité des XY femelles n’ont pas de mutation dans le gène Sry. La duplication d’un gène sur le chromosome X-Dax1-peut donner des XY femelles Dax-1 s’exprime dans les même cellules que Sry, au même moment mais l’expression continue après Sur-exprime Dax-1 chez M.musculus musculus: pas d’effet Sur-exprime chez M.musculus poschiavinus ( allèle faible de Sry) faible changement dans les gonades. Plus probable que le rôle de Dax-1 est d’empêcher le développement mâle chez la femelle intéraction avec SF1, molécule essentiel pour le développement mâle.

Rôle de Sox3 ? >100 XX mâle où Sry ne s’exprime pas Beaucoup plus probable qu’il s’agit d’une inhibiteur de l’expression de Sry qui est muté qu’un gain-of function. Modèle: SOX9 est essentiel pour devenir mâle SOX3 peut inhiber Sox9femelle SRY peut inhiber Sox3 Donc SRY et SOX3 sont des inhibiteurs et pas des activateurs?

L’expression de Sry dans le cerveau Testosterone est central pour le développement du comportement mâle SRY est produite dans les même cellules qui produisent tyrosine hydroxylasesynthèse de dopamine Anti-sens oligonucléotides inhibition de SRY empêche la fonction des cellules essentielles dans les fonctions moteurs chez le rat Chez la femelle les oestrogens peuvent assurer la fonction de SRY De plus….. Sry peut agir comme facteur d’épissage Les transcrits de Sry sont parfois circulaire et non-fonctionnels

Role du gène Foxl2 Mutations dans ce gène empêche le développement de l’ovaire et sont associées avec XX sex-reversal Absence de l’expression de Foxl2 change le développement de 2 linéages: Les granulosa cells Sertoli like Les theca cells ( synthèse des steroids) synthetisent le précurseur de la testosterone Rôle de Foxl2: réprime l’expression de Sox9 dans l’ovaire Foxl2 fonctionne avec le récepteur de l’oestrogen ( ce qui explique en partie le sex reversal associé avec des problèmes des hormones)

L’activation de Sox9 est inhibe par l’expression de FOXL2 a) TESCO ( Testis specific enhancer of Sox9) active un gène rapporteur dans le testis mais pas dans l’ovaire c) Par ChiP FOXL2 peut se fixer sur la séquence TESCO d) FOXL2 peut reprimer l’expression d’un gène rapporteur sous le contrôle de TESCO

Model of Sox9 Regulation Required for Maintenance of Gonadal Phenotype in Mammals Cell 139, 1130 2009

DMRT1 Double-sex and Mab3-related transcription factor 1 Nature 476: delete Dmrt1FoxL2 expressiontestis become ovaries

Tortoiseshell cat/ Ecaille de tortue

X-linked diseases a

L’inactivation du chromosome X pendant la vie d’une souris

L’inactivation aléatoire du chromosome X chez la femelle L’embryon a reçu un allèle normal et un allèle mutant de ses parents. Dans le cas où la mutation désavantage les cellules, ces cellules peuvent être éliminé et donc le résultat de l’inactivation est biaisé.

Le gène Xist Xic ( X Inactivation Center ) identifié par les translocations Cherchez un gène dans cette région qui s’exprime uniquement à partir du chromosome X inactif Xist: X Inactive chromosome Specific Transcript: 17kb, pas de cadre ouverte de lecture, toujours dans le noyau, jamais dans les polyribosomes Pas d’expression chez les mâles Présent dans plusieurs espèces différents

Conservation des séquences dans les gènes Xist: les A repeats (1) sont le plus conservées ainsi que la région 4. Les transcrits Xist sans les A repeats ne fonctionnent plus ( les transcrits sont localisés sur le chromosome en cis mais sans inactiver). H=human M=mouse R,A,T,K= 4 compagnoles (voles) Conserved elements in Xist RNA. (a) Gene structure and tandem repeats in human, mouse and vole Xist genes. Exons are represented as thick lines. Note that the overall gene structure is well conserved, although primary sequence shows a relatively rapid rate of evolutionary change (see text). Many regions of the exonic sequence comprise tandem repeats (A, represented by different colours). The repeats are unique relative to one another. Some are highly conserved between species whereas others are either amplified differentially or present in only one species (for further details see Refs [5, 6, 19 and 20]). (b) Expanded view of the mouse Xist gene showing the location of the two major promoters, P1 and P2. The regions of Xist RNA that have been deleted in gene targeting studies (Δ1 and Δ2 – see text) are highlighted, as are regions that exhibit relatively high primary sequence conservation [1, 2, 3 and 4]. Boxes illustrate predicted structures for region [1], the A-repeats (as described in Ref. [21] – the structure shown is of one of eight repeat units) and the highly conserved exon 4 region. The predicted stem-loop structure for exon 4 is shown for human (H), mouse (M) and four different species of vole (R, A, T and K).

La région Xic: a) 5 ARN non-codantes sont détectés: b) Xist s’exprime au début à partir des 2 X chez les cellules femelles et ensuite un des deux X montre une forte expression

Le gène Tsix Délétion de 65kb dans le région 3’ du Xist . Le chromosome X avec cette délétion est toujours inactivé Dans cette région on trouve la région 5’ d’un gène Tsix transcrit dans l’autre sens de Xist Xist------------------------------ -------------------------------------------------------------------------- Chr X -----------------------------------Tsix -------------------Xic-----------------------------

Plusieurs allèles de Xic Les allèles plus ou moins forts de Xic existe: a<b<c<d Dans une souris Xic a/Xic c: X avec l’allèle a est 80% du temps inactivé: c’est plus aléatoire La dominance des allèles est associé avec le niveau de transcription en amont du début de transcription de Tsix: 6kb région identifié a (allèle faible) montre une transcription moins important que l’allèle c Introduit les mutations dans cette région--- des transcripts tronqués: pas d’effet sur la dominance. Un enhancer?? Stockage des facteurs de transcription?

Histone Code

Modifications des histones du gène Xist

Xist inactivation complèxe

Etapes moléculaires pendant l’inactivation du chromosome X

Counting chromosomes….la suite Tel---------------------------------------------------------------------------Cen Xist---------- ------------------Tsix -------- Délétion 5’Tsix (a) --------/------/------ Tr 5’Tsix (b) Souris a) toujours le X avec la délétion inactivé: site du blocking factor Souris b) Si cette région contient le site pour le blocking factor, ce transgène devrait éponger le factor--X-inactivation chez le male. On ne voit pas cela. On ne trouve pas les transcrits du gène Xist sur le transgène ou le chromosome X. Souris a) homozygous: la moitié des cellules meurent: les cellules inactivent soit un, soit deux chromosomes X. Chaotique.

Counting Chromosomes Blocking factor produit par les autosomesun chromosome X est protégé contre l’inactivation Competence Factor produit par les chromosomes X et il faut deux doses pour inactiver

Les étapes principaux pendant l’inactivation du chromosome X

Les séquences LINE Les transcrits du gène Xist sont essentiels pour l’inactivation: c’est pas juste l’activation du promoteur et une changement dans la chromatine. 2000 transcrits Xist par cellule: pas suffisant pour couvrir tout le chromosome. Le chromosome X est riche en séquences LINE ( Long Interspersed Nuclear Elements). Présent aussi sur les autres chromosomes. Les transcrits Xist se fixent sur les séquences LINE: un complexe se forme qui change la conformation du chromosome dans un région autour de ce complexe

L’inactivation du chromosome X pendant le développement de la souris

Gènes qui echappent à l’inactivation chez l’Homme: Beaucoup moins échappent chez la souris: pas de centromère? Les gènes qui échappent chez l’homme ont peut être une fonction spécifique aux femmes? Certains gènes peuvent être inactivé et ensuite réactivé XO chez l’homme et chez la souris?

X-Escapées 15% des gènes sur le X échappent chez l’homme 3% échappent chez la souris Les gènes qui échappent ont une expression souvent moins important que la copie sur le X actif Chez l’homme les éscapées sont dans les blocs Chez la souris ils sont isolés et dans la chromatine silencieux Chez l’homme les gènes qui échappent sont variables selon l’individuel et selon le tissu Les gènes qui échappent peuvent être réactivé

Escapées…la suite Les études sur les gènes qui échappent sont importants pour comprendre le mécanisme moléculaire de l’inactivation. Pas de ARN Xist sur les éscapées Moins de séquence LINE Moins de motif ‘AT rich’ qui sont aussi associés avec l’inactivation Moins de méthylation des histones, plus d’acetylation CTCF: protéine qui peut ‘isoler’ les séquences. CTCF se fixe sur la chromatine entre un gène qui s’exprime et un gène qui est inactivé chez la souris: chez l’homme les 2 gènes sont inactivés et CTCF ne se lie pas.

…..et fin Les gènes qui sont impliqués dans les différences entre les femelles et les mâles sont très présents sur le X: plutôt les gènes activé par les hormones . Souris XY KO pour Sry avec Sry transgène sur un autosome (XY-Sry) ( donc Y-=Y moins le Sry). On va avoir des cellules avec le chromosome Y sans ou avec le transgène Sry. Croisement avec femelle XX 4 possibilités XY-Sry x XXXXSry (mâle) XX (femelle) XY- (femelle) XY-Sry (mâle) XX Sry ( mâle) et XY- Sry (mâle) sont différents ( comportement, expression des gènes) La majorité des gènes qui échappent chez la souris et la femme ont une fonction dans le cerveau. Trisomy XXX: 1/1000 Problèmes comportement variable chez les femmes

The X in sex: how autoimmune diseases revolve around sex chromosomes ….’the predominance of affected women, and perhaps its most intriguing putative mechanism is related to sex chromosomes, based on the recent observation that women with autoimmune diseases manifest a higher rate of circulating leukocytes with a single X chromosome.’ Haploinsufficiency???

Modèle pour expliquer comment des gènes peuvent échapper à l’inactivation

L’inactivation du chromosome X est différente dans les espèces différentes

Quelques observations en plus……. Les méthodes utilisé dans les cellules humaines et les cellules murines sont probablement différentes…. Rôle du Tsix moins clair chez l’homme: les transcrits sont tronqués ou parfois absent Rôle possible des RNAi: une hybridation entre les transcrits Xist et Tsix donne une molécule double brin qui est clivée par Dicer: les RNAi sont supposés contrôler l’inactivation. KO pour Dicerpas d’inactivation et léthale chez les femelles.