Utilisation des systèmes viraux comme vecteurs d’expression de gènes Vectorologie Utilisation des systèmes viraux comme vecteurs d’expression de gènes Etienne Decroly, CNRS Edecroly@free.fr

Utilisation des systèmes viraux comme vecteurs d’expression de gènes Les virus constituent des systèmes d’expression spécialisés Question ? Peut-on les utiliser pour exprimer selon nos besoins des protéines d’intérêt dans une cellule cible? Oui, les virus sont à l’origine de plusieurs systèmes d’expression utilisés à ce jour Thérapies génique biotechnologies Exemples : phage display vecteurs d’expression viraux vaccination

Vecteurs viraux courants (eucaryotes) Efficacité Ciblage Problèmes liés aux ADN nus : Vecteurs réplicatifs Vecteurs se répliquant de manière autonome Pas d ’utilisation en thérapie génique Utilisation en biologie moléculaire, cellulaire, biochimie, biotechnologie à l ’échelle industrielle, vaccinologie et expression des protéines Exemples : Pox Virus (Vaccinia virus) : cellules mammifères, tropisme large Baculovirus : cellules d ’insectes, expression très élevée ! Vecteurs dérivés non réplicatifs en cellules mammifères Vecteurs non réplicatifs Les virus recombinants ne se répliquent que dans des cellules exprimant les gènes essentiels à la réplication délétés dans la construction du vecteur : « packaging cell lines » Utilisation en biologie moléculaire et thérapie génique Adénoviraux : Ad2 & Ad5 Rétroviraux : MLV, lentiviraux( HIV) Adéno associés : famille des parvovirus Alphavirus : SFV

Caractéristiques recherchées pour un vecteur viral (thérapie génique) Tropisme cellulaire adaptable (choix des enveloppes virales) Régulation de la transcription possible (choix des promoteurs) Stabilité d’expression (intégration ou épisomes, immunogénicité faible) Matériel génétique inséré de grande taille (de 3 à 100kb) Ciblage et Expression Recombinaison faible voir absente Toxicité faible (immunogénicité faible, intégration dirigée) Réponse immunitaire faible (expression minimum de gènes viraux) Sécurité « Packaging cell lines » aisément cultivables Production de virus à hauts titres infectieux Production

Comment construire un virus recombinant réplicatif ? Identifier un gène non essentiel à la réplication, ou conditionnellement nécessaire Remplacer ce gène non essentiel par le « trans gène » (TG)

Poxvirus : cycle du virus de la vaccine Virus ADN double-brin linéaire (200 kb) 10% des protéines totales de la cellule sont des protéines de la vaccine Cycle entièrement cytoplasmique Infection de tout type cellulaire mammifère et aviaire (sauf CHO)

Construction de virus recombinants Le gène codant pour la protéine tymidine Kinase (TK) n’est pas essentiel à l’infection virale dans des cellules en division Principe : Introduire le TG par recombinaison homologue dans le gène TK Virus de la vaccine Infection pro MCS Transgène Séquences du gène TK Promoteur Vaccine 5’ 3’ Choix du promoteur (précoce ou tardif) Transfection Noyau Cellules Mammifères Recombinaison homologue 0,1 à 0,5% Virus de la vaccine Recombinant (TK-/TG+) + virus WT (99,9%)

Sélection et purification des virus recombinants C’est l’étape limitante : Sélection des virus TK-: en présence de BrdU (5-bromodéoxyuridine) , la TK phosphoryle le BrdU qui est incorporé dans le génome viral (létal) sélection en incorporant un gène de résistance aux antibiotiques ou le gène lacZ (blanc bleu) Purification des virus: Par dilution limite (plage de lyse) Plusieurs cycles nécessaires Contrôle de l’expression des TG PCR Western Blot

Avantages et limitations du système vaccine Utilisation principale : expression de protéines en cellules mammifères Constructions de virus recombinants : Construction du plasmide difficile (recombinaison) Choix possible du promoteur (précoce ou tardif, fort ou faible) Sélection des virus recombinants et purification longues Production de stocks de virus recombinants facile Inconvénients Les virus WT et recombinants sont infectieux et immunogène pour l ’homme (yeux) Ce sont des virus infectieux… (L2 ou L3)  utiliser la souche Ankara MVA atténuée La vaccine perturbe les métabolismes cellulaires :Expression des protéines endogènes  Effet cytopathique : les cellules infectées meurent 48 h après infection Infecte seulement les cellules en division Avantages Niveau d’expression élevé Modifications post-traductionnelles ad-hoc (glycosylation, clivages protéolytiques) Taille des inserts > 20kb Production aisée de titres infectieux (1010 PFU/ml) Choix du promoteur (précoce ou tardif) Ancien vecteur de choix pour les vaccinations Transcription cytoplasmique (pas de problème d ’export des ARNm, pas d ’épissage)

Système vaccine T7 Pol : transfection/infection (1) Construction d’un virus de la vaccine recombinant exprimant la T7 Pol Virus de la Vaccine (WT) Infection pro T7pol 5’ 3’ Transfection Noyau Cellules Mammifères Recombinaison homologue 0,1 à 0,5% Sélection et purification de virus de la vaccine recombinant exprimant la T7 Pol

Système vaccine T7 Pol : transfection/infection (2) Expression de gènes sous le contrôle de la T7 polymérase : VV: T7 Pol 3. Infection 1. Construction d’un plasmide pro MCS Transgène Promoteur T7 Pol 2. Transfection Noyau pro TG T7 polymérase exprimée par le VV ARNm Protéines Avantages/Inconvénients Expression aisée de multiples constructions La transfection est une étape limitante pour les productions industrielles Transcription cytoplasmique (pas de problème d ’export des ARNm, pas d ’épissage)

nécessaire pour l’infection d’un nouvel hôte Baculovirus Virus ADN double-brin circulaire (130Kb) pH dépendante Phases tardives Phases très tardives Polyhédrine nécessaire pour l’infection d’un nouvel hôte arthropodes (lépidoptères, SF9)

Formation de baculovirus recombinants Particularités de la polyhédrine : Niveau d ’expression très élevé (jusqu’à 50% du total cellulaire) Protéines non essentielles à la propagation de l ’infection Les virus recombinants ∆ polyhédrine ont une morphologie identifiable dans la cellule  recombinaison homologue dans le gène de la polyhédrine. pro MCS Transgène Séquences baculovirales polyhédrine Promoteur polyhédrine 1. clonage Baculovirus 3. Infection 2. Transfection Noyau Cellules SF9, SF 21 Recombinaison homologue 0,1 à 0,5% Baculovirus recombinant

Vecteurs baculoviraux commerciaux 99% de recombinants

Avantages et limitations des vecteurs baculoviraux Utilisation principale : expression de protéines en cellules d’insectes, vaccins recombinants, production de protéines insolubles en bactéries. Avantages Promoteur très fort, niveau d’expression élevé Modifications post-traductionelles proches du système mammifère Glycosylations : high-mannose mais pas hybride et complexes Transport et processing ad-hoc Taille des inserts > 50kb Production aisée de titres infectieux (1010 PFU/ml) Pas d ’infection possible de l ’homme (restriction au niveau de la transcription) Inconvénients Virus lytique (chez l ’insecte) La formation des virus recombinants est une étape limitante

Vecteurs de deuxième génération pour thérapie génique Le baculovirus est capable d’infecter des cellules mammifères (récepteur présent) Toutefois ces gènes ne sont pas transcrits L ’activation des unités transcriptionelles est restreinte aux cellules d’insectes  L ’intégration d’un transgène (TG) en aval d’un promoteur eucaryote permet l ’expression du TG Avantages Production aisée de hauts titres infectieux Tropisme large (récepteurs inconnus) Pas de réplication ni de production de protéines virales chez l’hôte Survie des cellules infectées (virus lytique chez l ’insecte) Insert de grande taille (50 kb) et choix possible des promoteurs Risque de recombinaison très faible « Packaging cell lines » : pas de construction complexe (SF9) Inconvénients Pas d ’intégration, persistance limitée Non déterminé Réponse immunitaire ? Infection des cellules quiescentes? Song SU, Boyce FM. Exp Mol Med. (2001) Mar 31;33(1):46