Etude du protocole du TP2 Généralités sur les intégrines Sylvie Monferran

Etude du protocole du TP2 4 manips / 3 jours qui se chevauchent TP: projet de recherche… autonomie Compte-rendu sous forme d’un article scientifique Résumé: à faire à la fin Introduction: sur les intégrines Matériels et méthodes: principe de chaque expérience Résultats et discussion: critique des résultats Conclusion et perspectives

Adhérence cellulaire Adhérence intercellulaire Adhérence homotypique: interaction entre cellules du même type cellulaire Adhérence hétérotypique: interaction entre cellules de type cellulaire différents Adhérence cellulaire à la matrice extracellulaire Extracellular matrix Nature Review in Molecular Cell Biology

Molécules d’adhérence cellulaire Frenett et al, N Engl J Med, 1996 Ca2+ dépendantes: cadhérines, sélectines, intégrines Ca2+ indépendantes: CAM

Intégrines: récepteurs de la matrice extracellulaire Lame basale Matrice interstitielle

Famille des intégrines 8 sous-unités b, 18 sous-unités a: 24 intégrines Liaison à un ligand matriciel Liaison à un CAM Hynes, Cell, 2002

Spécificité des ligands des intégrines beta1   Ligands alpha1 Collagens, Laminins alpha2 alpha3 Laminins, Fibronectin, Thrombospondin alpha4 Fibronectin, VCAM alpha5 Fibronectin alpha6 Laminins alpha7 alpha8 Fibronectin, Tenascin alpha9 Tenascin alpha10 Collagens alpha11 alphav Fibronectin, Vitronectin beta2 alphaL ICAMs alphaM Fibrinogen, ICAMs, iC3b alphaX Fibrinogen, ic3B alphaD VCAM, ICAMs beta3 alphaIIb Collagens, Fibronectin, Vitronectin, Fibrinogen, Von willebrand factor, Thrombospondin Fibronectin, Vitronectin, Fibrinogen, Von willebrand factor, Thrombospondin beta5 Vitronectin beta6 beta7 Fibronectin, VCAM, MAdCAM alphaE E-cadherin beta8 Collagens, Laminins, Fibronectin

Structure des intégrines MIDAS Zone d’interaction avec le ligand Domaine extracellulaire: Interaction avec le ligand Domaine I/A (vWA) Sept domaines répétés en hélices b Liaison à un cation (Ca2+) Domaine transmembranaire: Ancrage dans la membrane plasmique Domaine cytoplasmique: Interaction avec protéines de signalisation et du cytosquelette via la sous-unité b Membrane plasmique Chaîne a Chaîne b Humphries, Biochemical Society, 2000

Activation des intégrines -Activation par l’extérieur de la cellule: liaison au ligand Signalisation outside-in Conformation inactive (recourbée) Conformation active: Liaison avec le ligand Hynes, Cell, 2002

Activation des intégrines -Activation par l’intérieur de la cellule: liaison à des partenaires protéiques Signalisation inside-out Qin, Plos biology, 2004 Tadokoro, Science, 2003 Liaison des CHO exprimant aIIbb3 à PAC-1 PAC-1: anticorps mimant la liaison de l’intégrine aIIbb3 au ligand LIBS6: anticorps activant l’intégrine aIIbb3 par l’extérieur

Signalisation des intégrines Protéines adaptatrices GRB2, CAS Sos GDP GTP RAS Activité enzymatique Kinases: FAK, PKC GTPases Rho: Rac, ras = MEKK P P = MAPK Protéines effectrices MLCK Hood et Cheresh, Nat Rev Cancer, 2002

Signalisation des intégrines: la FAK Structure et activation: KO FAK: Léthalité embryonnaire à J8 Défaut de migration des cellules du mésoderme Ilic et al, Nature, 1995 Vidéomicroscopie sur des « fibroblastes » d’embryons de J8 FAK +/+ FAK -/- Activation de FAK aux points de contact cellule/matrice extracellulaire: Cônes de croissance chez le Xénope Robles and Gomez, Nat Neuroscience, 2006

Liaison au cytosquelette d’actine sauf l’intégrine a6b4 qui se lie aux filaments intermédiaires Points focaux d’adhérence: plus de 50 protéines identifiées Protéines liant l’actine et permettant la stabilisation des filaments d’actine pré-existants Taline, parvine… Actine/ myosine Nucléation de nouveaux filaments d’actine Arp 2/3, formine… Adhérence Migration Delon et al, Current Opinion in Cell Biology, 2007

Fonction des intégrines Intégrine a3b1 empêche la migration des kératinocytes murins (MK) Margadant, JCS, 2009 Test de migration Explants de peau Epiderme Derme Matrice extracellulaire Survie cellulaire Migration cellulaire Réorganisation du cytosquelette Contrôle de la transcription Prolifération cellulaire Hynes, Cell, 2002

Pathologies associées aux intégrines (1) LAD (leukocyte adhesion deficiency): -défaut de recrutement aux sites d’infection des monocytes ou des neutrophiles -mutations dans le gène codant pour la sous-unité b2 des intégrines: LAD I -inhibition de l’expression de b2: LADI -ou expression d’une forme de b2 qui n’est pas présente à la membrane plasmique ou ne peut pas conduire le signal : LAD I variant Bunting, Curr Opinion Hematol, 2002

Pathologies associées aux intégrines (2) Cancers: - Changement de localisation subcellulaire ex: l’intégrine a6b4 (marquage en jaune) dans une lignée de carcinome squameux Bello, Neurosurgery, 2001 -Changement du répertoire des intégrines (inhibition des intégrines qui maintiennent les cellules attachées à la membrane basale et expression des intégrines qui permettent invasion, ..) Ex: l’intégrine avb3 exprimée dans les glioblastomes (GBM) mais pas dans le cerveau sain (NB) Intégrine avb3 Cerveau sain Glioblastome Rabinovitz, JCB, 1999

Régulation des voies de signalisation des intégrines par d’autres récepteurs Guo, Nat Rev Mol Cell Biol, 2004

Signalisation croisée entre l’intégrine a6b4 et le R de l’EGF type II (ErbB2, neu) Implantation orthotopique Acini mammaire IP Signalisation b4 Signalisation b4 Implantation ectopique Guo, Cell, 2006 prolifération invasion

Inhibition directe des intégrines Expression des intégrines Interférence d’ARN Activité des intégrines Anticorps bloquants Activité des intégrines Molécules peptidomimétiques Tucker, Curr Oncol Rep, 2006

Inhibition indirecte des intégrines Inhibition des voies de signalisation Inhibiteurs pharmacologiques dirigés contre la protéine cible Ex: PKC Substrat non hydrolysable Ligand compétitif ATP Pseudo substrat

Méthodologie pour étude des intégrines Déterminer le type d’intégrines exprimé par une cellule Expression totale Western-Blot Expression à la surface externe des cellules Cytomètrie de flux Immunofluorescence Biotinylation des protéines de surface, puis Immunoprécipitation puis Western Blot Test indirect Test d’adhésion en présence d’inhibiteurs pharmacologiques des intégrines (anticorps bloquants, agents peptidomimétiques)

Méthodologie pour étude des intégrines Déterminer quelle est la voie de signalisation activée par une intégrine Etude de l’expression/activité des protéines en aval des intégrines en utilisant des inhibiteurs pharmacologiques ou des ARNi dirigés contre les intégrines ou en activant les intégrines Caractérisation des molécules de signalisation (co-précipitations, Western-Blot)

Méthodologie pour étude des intégrines Déterminer la fonction d’une intégrine Test d’adhésion sur protéines matricielles Schéma expérimental : +/-Anticorps/Inhibiteurs des intégrines 16 h 4°C 2-6 h 37°C DO Substrat Cellules Fixation Coloration

Système Cre-Lox