Régulations post-transcriptionnelles de l'expression génétique au cours du développement Luc Paillard CNRS UMR 6061 Faculté de médecine Université Rennes 1 http://perso.univ-rennes1.fr/luc.paillard/ensgnmt/odonto080307.ppt

Introduction Place des régulations post-transcriptionnelles Fonctions cellulaires Activité "spécifique" (phosphorylations…) Dégradation Activité des protéines Concentrations Traduction Transcription Maturation Concentration d'ARNm Traductibilité Synthèse Dégradation des ARNm

Maturation des ARNm eucaryotes Ajout d’une queue poly(A) Introduction Maturation des ARNm eucaryotes ADN Transcription ARN prémessager Ajout d’une queue poly(A) à l’extrémité 3’ 5' Ajout de coiffe (Cap) 7mG-PPP-N Excision des introns Epissage des exons Exon 1 Exon 2 Exon 3 5' Intron 1 Intron 2

Structure des ARNm eucaryotes Après l’épissage des exons! Introduction Structure des ARNm eucaryotes Après l’épissage des exons! Région 5' non codante (5'UTR) Région 3' non codante (3'UTR) Queue poly(A) Phase codante 5' AAAA…AAA 3' Coiffe (Cap) 7mG-PPP-N AUG STOP

1. Epissages différentiels et développement 2. Traduction, stabilité et état d’adénylation 3. Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codants

1. Epissages différentiels et développement Exons alternatifs Situation 1 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 3’ Exon 4 5' Situation 2

Et beaucoup d’autres possibilités… 1. Epissages différentiels et développement Exons alternatifs Situation 1 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 3’ Exon 4 5' Situation 2 Saut d’exon Situation 1 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 5' Situation 2 Et beaucoup d’autres possibilités…

1. Epissages différentiels et développement L’exemple de la différenciation sexuelle chez la drosophile Gène sex-lethal : transcription sous le contrôle de facteurs de transcription activiteurs et inhibiteurs Activateurs produits par le chromosome X Inhibiteurs produits par des autosomes Femelles XX : activateurs>inhibiteurs Synthèse sxl Male XY activateurs<inhibiteurs Pas de synthèse sxl (Pas de compensation de dosage…)

1. Epissages différentiels et développement L’exemple de la différenciation sexuelle chez la drosophile La protéine sxl contrôle l’épissage alternatif de transformer STOP Male : pas de sxl Protéine tra tronquée : inactive Femelle : sxl sxl STOP Protéine tra active

1. Epissages différentiels et développement L’exemple de la différenciation sexuelle chez la drosophile La protéine tra contrôle l’épissage alternatif de doublesex Male : tra inactif Femelle : tra actif tra Protéine dsx a un exon en plus chez la femelle que chez le male Même activité de liaison à l’ADN, mais effets différents sur la transcription

2. Traduction, stabilité et état d’adénylation L’exemple du développement précoce du xénope ARN Northern blot Fraction A- Fraction A+ Oligo(dT) cellulose Extrait (œuf ou embryon) Centrifugation sur gradient de saccharose Polysomes (traduit) Monosomes (non traduit) Northern blot

Northern blot 1. Electrophorèse des ARN Gel d'agarose 3. Hybridation avec une sonde radioactive complémentaire d'un ARN Sonde radiomarquée hybridée 2. Transfert sur membrane Membrane de nylon 4. Autoradiographie Le film photo est impressionné par la radioactivité

Corrélation état A+ et traduction, état A- et absence de traduction Etat d'adénylation et traduction Paris et Philippe (1990) Dev Biol 140, 221 Corrélation état A+ et traduction, état A- et absence de traduction

Les variations de longueur de la queue poly(A) régulent l'expression génétique Stimulation traductionnelle Répression Stable Traduit Non traduit Instable en général Stable chez le xénope jusqu ’à la MBT Polyadénylation Désadénylation AA..AA CADRE DE LECTURE 5 ’ 3 ’

Recherche d'éléments contrôlant la polyadénylation cytoplasmique (1) Certains ARNm sont polyadénylés pendant la maturation ovocytaire Mais qu’est-ce que la maturation ovocytaire? Méiose (PI à MII) Pas de transcription Peut être faite in vitro (progestérone)

Recherche d'éléments contrôlant la polyadénylation cytoplasmique (2) Alignement des séquences d'ARNm polyadénylés pendant la maturation ovocytaire McGrew et al. (1989) Genes Dev 3, 803

Recherche d'éléments contrôlant la polyadénylation cytoplasmique (3) Test de la séquence : principe Injection d'ARN synthétisés in vitro, radiomarqués, contenant ou non la séquence à tester Extraction des ARN après incubation (en présence ou non de Pg) Électrophorèse, autoradiographie A0 A+ t0 t1 ARN polyadénylé pendant l'incubation ARN non polyadénylé

Recherche d'éléments contrôlant la polyadénylation cytoplasmique (4) Test de la séquence : Résultats Une séquence non spécifique (AAUAAA) et une séquence spécifique sont nécessaires à la polyadénylation cytoplasmique La séquence spécifique a été appelée CPE (Cytoplasmic Polyadenylation Element) McGrew et al. (1989) Genes Dev 3, 803

Régulation de la polyadénylation dépendante du CPE Identification de la CPEB (CPE Binding protein) Modèle : - Le CPE lie la CPEB - La CPEB provoque la polyadénylation des ARNm auxquels elle est liée Pourtant : - La CPEB est présente dès le début de l'ovogenèse...

Régulation de l'activité de la CPEB A. Dans l'ovocyte non maturé CPEB CPE 3' 5' Pas de traduction B. Pendant la maturation ovocytaire Progesterone CPEB P CPE AAA…AAA 3' + 5' Eg2 protein Traduction

Fonction de la polyadénylation contrôlée par la CPEB L’injection d’anticorps anti CPEB bloque la maturation ovocytaire Identification de certains ARNm dont la polyadénylation est nécessaire à la maturation (c-mos…)

Souris dont le gène CPEB est inactivé… Mais ce n’est pas tout! Souris dont le gène CPEB est inactivé… Fonction dans le fonctionnement neuronal

Et les désadénylations?

Contrôles aberrants de l’état d’adénylation des ARNm et pathologies humaines Exemple 1 L'ARNm a-globine est très stable pendant la différenciation érythrocytaire Cette stabilité lui est conférée par un élément de séquence dans la 3'UTR Cet élément maintient une queue poly(A) longue sur l'ARNm a-globine Une forme de thalassémie est liée à l'inactivation de cet élément

Contrôles aberrants de l’état d’adénylation des ARNm et pathologies humaines Exemple 2 Les ARNm des cytokines ou proto-oncogènes sont souvent très instables Cette instabilité leur est conférée par un élément de désadénylation dans la 3'UTR L'inactivation de cet élément conduit à la surexpression de la protéine codée Cette surexpression peut être associée à une transformation cellulaire

3. Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codants Une histoire récente… Et alors? miRNA RNAi Prix Nobel oct 2006 (C Mello, A Fire) siRNA Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

3. Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codants Une histoire récente… Mécanismes biochimiques Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

double brin par Argonaute! Biosynthèse des miRNA Reconnaissance d’un ARN double brin par Argonaute! Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

Conséquence : inhibition de la traduction de l’ARNm cible Fonction des miRNA L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNm cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN 1. Hybridation imparfaite sur les 22 nt : Conséquence : inhibition de la traduction de l’ARNm cible Voie miRNA « classique » chez l’animal Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

Conséquence : dégradation de l’ARNm cible Fonction des miRNA L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNm cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN 2. Hybridation sur la totalité des 22 nt : Conséquence : dégradation de l’ARNm cible Voie miRNA « classique » chez la plante Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519

Conséquence : dégradation de l’ARNm cible Fonction des miRNA L’ARN simple brin (22nt) s’hybride à un ARNm cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN 2. Hybridation sur la totalité des 22 nt : Conséquence : dégradation de l’ARNm cible Voie miRNA « classique » chez la plante… … Mais si l’on apporte un ARN double brin parfaitement complémentaire d’un ARNm cible chez l’animal, cela provoque sa dégradation… voie « siRNA » chez l’animal

miRNA : ARN double brin (2*22nt) codé par le génome Reprenons… miRNA : ARN double brin (2*22nt) codé par le génome de la cellule (sous forme d’un précurseur qui est maturé) Environ 250 chez l’humain S’apparie imparfaitement à un ARN cible et inhibe sa traduction (animal), ou s’apparie parfaitement et provoque sa dégradation (plante) (Il y a des exceptions…) En général, un miRNA s’apparie aux 3’UTR d’un ou plusieurs ARNm siRNA : ARN double brin (2*22nt) apporté par l’expérimentateur dans une cellule animale S’apparie parfaitement à un ARNm cible et provoque sa dégradation

L’expression d’un ARN double brin (2*22nt) dans une cellule Utilisation des siRNA L’expression d’un ARN double brin (2*22nt) dans une cellule animale provoque la dégradation des ARNm dont la séquence est parfaitement identique à celle de l’un des deux brins Applications en recherche… … Et en médecine?

Régulations post-transcriptionnelles par les miRNA et développement L’exemple de Caenorhabditis elegans

La vulve de Caenorhabditis elegans proximité de la vulve. *

* Formation de la vulve P6.p se divise en cellules qui se proximité de la vulve. P6.p se divise en cellules qui se différencieront en cellules centrales de la vulve P5.p et P7.p se divisent en cellules qui se différencieront en cellules latérales Rôle de AC (induction) *

Les inductions dans la formation de la vulve Première induction (voie EGF) Deuxième induction (voie Notch) « Marqueurs » de destinée cellulaire Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330

La GFP “marque” les cellules P5.p et P7.p, mais pas P6.p Contrôle Le miRNA mir-61 est présent dans P5.p et P7.p, mais pas P6.p Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330

… Sauf si on exprime le miRNA mir-61 dans P6.p Contrôle Expression de mir-61 dans P6.p Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330

… Sauf si on fait s’exprimer le miRNA mir-61 dans P6.p Contrôle Expression de mir-61 dans P6.p mir-61 exprimé dans P6.p « fait devenir » P6.p comme P5.p et P7.p Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330

Recherche d’un ARNm cible de mir-61 Fonction de la protéine codée par cet ARNm : faire « devenir une cellule comme P6.p » Dans l’embryon normal : mir-61 est présent dans P5.p et P7.p Il empêche l’expression de cet ARN dans P5.p et P7.p P5.p et P7.p deviennent « comme P5.p et P7.p » Si on exprime mir-61 dans P6.p Il empêche l’expression de cet ARNm dans P6.p aussi P6.p devient « comme P5.p et P7.p » ARNm codant la protéine vav-1 Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330

D’où la fonction d’un miRNA dans la mise en place de la vulve… … Implication dans d’autres processus de développement chez C. elegans

Le cycle de C. elegans

Les mutants hétérochrones chez C. elegans Alvarez-Garcia et Mlska 2005 Development 132, 4653

Rôle de miRNA dans la coordination d’évènements de développement chez C. elegans Alvarez-Garcia et Mlska 2005 Development 132, 4653

miRNA et pathologies humaines (1) Mutation dans la 3’UTR de SLITRK1, au niveau du site de reconnaissance de miR-189 Perte de la répression traductionnelle de SLITRK1 : surexpression de la protéine SLITRK1 Responsable de la maladie?

miRNA et pathologies humaines (2)

miRNA et pathologies humaines (3)