Note sur 4 -compréhension : 2 -clarté : 2 - L’analyse des résultats de double hybride (fig 1B) montre que les protéines SRC1-N et GRIP1-N sont capables d’interagir avec LMP2 dans un système cellulaire comme la levure, en témoigne l’activation du gène rapporteur obtenu dans les cellules cotransfectées par les vecteurs pACT2-LMP2 et pGBKT7-SRC1N ou pACT2-LMP2 et pGBKT7-GRIP1N. - L’autoradiograhie présentée fig1C indique que les protéines SRC-1, GRIP1, A/B1, SRC-1-N,GRIP1-N, AIB1N interagissent physiquement avec la protéine GST-LIMP2 alors que ces mêmes protéines n’interagissent pas avec la protéine GST. De plus, les protéines SRC1-C, GRIP1-C et A/B1-C ne sont liées ni par la protéine GST, ni par la protéine GST-LIMP2. Cette expérience indique que les protéines SRC-1, GRIP1, AIB1 interagissent avec LMP2 via leur domaine N-terminale. - L’expérience de co-immunoprécipitation réalisée dans les cellules ECC1 montre que la protéine LMP2 est spécifiquement précipitée par l’anticoprs aLMP2 (elle n’est pas présente dans les extraits immunoprécipités par l’anticorps control). Par ailleurs, cette immunoprecipitation avec l’anticorps aLMP2 entraîne les protéines SRC-1 et GRIP1. La dernière expérience de GST pull-down montre que la protéine SRC-1 interagit physiquement avec le récepteur aux estrogènes alors que la protéine LMP2 n’en est pas capable. Note sur 4 -compréhension : 2 -clarté : 2

Note sur 4 -compréhension : 2 -clarté : 2 - La première expérience réalisée par WB montre que l’expression des protéines SRC1, GRIP1 et AIB1 n’est pas modifiée par l’expression de la protéine LMP2. Seule la quantité de protéine LMP2 augmente dans les cellules transfectées par le vecteur permettant l’expression de LMP2, comparé à la quantité de protéines observées dans les cellules contrôles (transfectées par le vecteur vide). Il n’y a pas d’action de LMP2 sur l’expression des coactivateurs. Les figures B et C montrent que l’E2 augmente l’expression des vecteurs CyclinD1luc, EREluc transfectés dans des cellules ECC-1. Par ailleurs, une analyse par RT-PCRQ montre que la quantité d’ARNm Cyclin D1 et pS2 endogène est également augmentée après stimulation par E2 dans ces cellules. Cette augmentation de la transcription des plasmides ou de la quantité des ARNm endogènes est accrue de manière significative lorsque les cellules expriment la protéine LMP2. Cette augmentation est abolit en présence de RNAi LMP2. LMP2 augmente la transcription des gènes estrogéno-dépendants. La figure D montre que la quantité de luciferase (produit du gène rapporteur) est plus importante dans les cellules co-transfectées par le vecteur d’expression LMP2 et les vecteurs exprimant les coactivateurs SRC-1, GRIP1 et AIB1, démontrant une coopération de ces protéines dans l’activation de la transcription du gène rapporteur. L’expérience de RNAi montre que lorsque les 3 membres de la familles p160 sont ciblés, l’expression du plasmide est inhibée. -La figure E rend compte de la quantité de chaque protéine SRC1, GRIP1, AIB1 et LMP2 dans les différentes conditions expérimentales. Note sur 4 -compréhension : 2 -clarté : 2

polII a Note sur 3 -compréhension : 1,5 -clarté : 1,5 LMP2 - La figure A permet de positionner sur le gène pS2 les régions amplifiées avec les différentes amorces utilisées dans les expériences de ChIP. La taille des fragments d’ADN est présentée dans la figure C. L’expérience de ChIP présentée figure B montre que en présence d’E2, la région du promoteur située entre -353 et -30 est immunoprécipitée par tous les AC utilisés, démontrant une proximité de ces facteurs sur le promoteur du gène pS2 et une association de ces protéines dans un même complexe. De plus, d’autres régions du gène sont immuno- précipités avec l’AC anti LMP2, démontrant que la protéine se localise à différentes position du gène. -La figure D montre que la région -353 -30 est précipitée avec les AC anti RE, SRC1, LMP2, polII mais pas avec l’AC anti elongin A. La figure D présente également les résultats d’une expérience de double IP. Les fragments d’ADN sont immunoprécipités à l’aide d’un premier AC, puis d’un deuxième AC. Après une 1er immunoprecipitation avec un AC anti RE, la région -353 -30 est immunoprécipitée avec les AC anti SRC1,LMP2 et polII. De même, après une immunoprecipitation avec un AC anti SRC1, la région -353 -30 est immu- noprécipitée avec les AC anti RE, LMP2 et polII. Note sur 3 -compréhension : 1,5 -clarté : 1,5 polII a RE SRC1 AIB1 GRIP1 LMP2 Rôle de LMP2 dans l’initiation de la transcription. Rôle de LMP2 dans la phase d’élongation?

Note sur 3 -compréhension : 1,5 -clarté : 1,5 Cette figure rend compte d’expériences de double ChIP réalisés à l’aide de différents anticorps. L’analyse de ces double ChIP montre que les protéines LMP2, polII et Elongin sont associées dans un même complexe. Ces résultats suggèrent que LMP2 joue également un rôle pendant l’élongation de la transcription. Note sur 3 -compréhension : 1,5 -clarté : 1,5

Note sur 3 -compréhension : 1,5 -clarté : 1,5 A. Cette figure montre le caractère cyclique du recrutement des protéines sur le promoteur. Ce recrutement cyclique des protéines ne se fait plus lorsqu’on empêche l’expression de LMP2 ou des protéines p160. Lorsqu’on bloque l’expression de LMP2, ces cycles de recrutement sont à nouveau possible si on exprime un peu plus tard la protéine LMP2. B. Ces western blot témoignent de la quantité des protéines étudiées en ChIP. C. Cette expérience montre l’augmentation de la transcription d’un vecteur rapporteur estrogénodépendant en présence de protéine LMP2. Le recrutement des co-activateurs sur le promoteur et l’activation de la transcription nécessite la protéine LMP2.

Note sur 3 -compréhension : 1,5 -clarté : 1,5 A. L’activation de la transcription médiée par E2 + LMP2 est abolit en présence d’inhibiteur du protéasome MG132.