Biotechnologie végétale Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale

Exemples d’utilisation en recherche fondamentale Cultures de plantules in vitro Approches pharmacologiques et toxicologiques Suspensions cellulaires et protoplastes Échanges membranaires, mécanismes signalétiques Adressage protéique Dédifférenciation, Différenciation Contrôle du métabolisme

Approches pharmacologiques sur plantules Déterminisme hormonal de la formation de racines secondaires Zhu et al.

Utilisation des suspensions cellulaires dans un contexte de signalisation cellulaire

Hypersensitive Response (HR) Interactions plantes / pathogènes Réaction rapide À plus long terme … HR Mort cellulaire Circonscription du pathogène SAR Systemic Acquired Resistance : « Immunisation des plantes »

Exemple typique : infection par le virus de la mosaïque du Tabac 3 jours d’infection Lam et al. (2001) Nature Nécroses = mort cellulaire Restriction de la propagation du virus

Caractéristiques histologiques de la réaction hypersensible Composés phénoliques (autofluorescence) Callose Mort cellulaire (Bleu Evans) H2O2 Ehrenfeld et al. 2005 Mol. Cells

Inconvénients du modèle plante entière Culture des plantes : En serre : dépendance des saisons Chambres de culture : coûteux Variabilité importante Dosages enzymatiques difficiles Problèmes de pigments Mesures de flux difficiles Utilisation difficile d’inhibiteurs

Utilisation de suspensions cellulaires Quantification de la mort cellulaire Utilisation d’inhibiteurs Petites quantités Rapidité d’absorption Facilités d’extraction et dosages Métabolites (SA, phénylpropanoides ROS, NO…) Activités enzymatiques Extractions d’ARN

Estimation de la mort cellulaire Colorants des cellules vivantes : Fluoresceine diacétate Rouge neutre des cellules mortes Bleu Evans, Bleu Trypan, Iodure de propidium Comptages sous microsope Comptages par fluorimétrie

Mort cellulaire : Nicotiana tabacum/ Phytophtora cryptogea H2O Cryptogéine Prélèvements et comptage de la mort cellulaire au cours du traitement Cryptogéine % mortalité Témoin heures

Recherche d’évènements précoces Cryptogéine % mortalité Témoin heures Que se passe-t-il pendant ces premières heures?

Synthèse des composés phénoliques Transcription du gène codant la PAL H2O Cry 50 µM Zhang et al. 1998 Plant Cell

Suivi des concentrations ioniques intracellulaires Exemple du calcium

Sondes calciques

Pénétration des sondes Problème : sondes chargées négativement, imperméantes Solution : dérivation avec un groupement acétométhylester (AM) Les molécules pénètrent les cellules Action d’esterases endogènes Libération des formes actives dans le cytoplasme

Inconvénients Sensibilité au pH : Compartimentation ? Changements de pH cytoplasmique plus qualitatif que réellement quantitatif

Suivi du calcium intracellulaire Système Nicotiana plumbaginifolia / apoaequorine

Mode d’action de la coelentérazine calcium Ca2+ coelentérazine Ca2+ Ca2+ + + O2 Ca2+ + CO2 +λ=469nm Ca2+ Ca2+ apoaequorine

Fluctuations de la concentration cytosolique de calcium Temps (min) Cry (0.5 mM Ca2+) Cry (0.4 mM Ca2+) Cry (0.3 mM Ca2+) Cry (0.2 mM Ca2+) Cry (0.1 mM Ca2+) 10 20 30 40 2,4 [Ca2+] cyt (µM) Lecourieux et al. 2002 Plant Cell

Elaboration d’un modèle de signalisation cellulaire Ca2+ Cry Mort cellulaire Phosphorylations (kinases) NO3- NADPH NADP H2O2 Modèle très simplifié d’une voie de transduction du signal entre la perception de la cryptogéine et la mort cellulaire (Nicotiana)

Utilisation de protoplastes en recherche Transport membranaire Adressage protéique Protoplastes tissu-spécifiques

Étude de transports membranaires Photoassimilats Minéraux, H2O Absorption racinaire Trafic vasculaire Relations Source / Puit

Étude de transports membranaires Problème des suspensions cellulaires: Agrégats Paroi végétale Les protoplastes : un modèle simple et pertinent

Étude de transports membranaires Traceurs isotopiques Sondes fluorescentes Electrophysiologie

Traceurs isotopiques Incubation protoplastes + 63Ni 10 µM Filtration et rinçage CaCl2 2 mM s Ni Ca Ni Ca Ca Ni Ni Ca Ni Ni Filtre 0.45µM Ni 5 mn Ni Comptage 63Ni dans le filtre = Ni intracellulaire

Sondes fluorescentes Protoplastes de blé chargés avec du BTC-5N (spécifique du Cd) Lindberg et al. (2004) Planta

Utilisation des protoplastes en électrophysiologie

Caractérisation de canaux voltage- dépendants Les solutés diffusent selon le gradient électrochimique. Comment caractériser la régulation électrique de canaux ? Voltage Clamp Patch Clamp

Voltage Clamp Une électrode enregistre les modifications de tensions La seconde impose une tension et corrige les variations Protoplaste Enregistrement des courants ioniques

Patch Clamp Mesure des courants sur une surface membranaire très réduite forte résistance : mesure de courants faibles étude d’un petit nombre de canaux

Patch Clamp : principes Imposition d’un potentiel membranaire Mesure d’un courant 100 pA 75 ms pA mV Assmann (2001) Plant Physiol.

Adressage des protéines Expression transitoire en protoplastes de protéines fusionnées avec une GFP

Canaux et transporteurs membranaires Souvent : faible niveau d’expression Fonction définie essentiellement par : Spécificité de substrat Expression tissulaire Adressage membranaire

Exemple d’une P-ATPase ADP P GFP Greffage d’une GFP sur une partie soluble

Green Fluorescent Protein Aequorea victoria Spécificité de la GFP: pas de groupement prosthétique synthétisé séparément modification d’acides aminés de la chaîne polypeptidique Stucture « cannette de feuillets β »

Hexapeptide : FSYGVQ

Expression transitoire : principe Insérer un fragment d’ADN codant un protéine dans un protoplaste Plasmide DNA double brin ou simple brin Observation directe de l’expression Pas forcément d’intégration chromosomique

Construction HMA4::GFP Promoteur Protéine de fusion 2x35S GFP HMA4 Ampi Ori coli Réplication et sélection dans E. coli

Transformation de protoplaste Préparer de grandes quantités de plasmide Transformation MaMg : Mannitol (0.5 M) MES-KOH (5 mM) pH 5,6 MgCl2 (15 mM) Polyethylène Glycol déstabilisation de la membrane

Transformation de protoplastes 300 µl PEG 40% 30 min sur glace 0-2 °C Rinçage par dilution / sédimentation : NaCl, CaCl2, Glucose Dans 300 µl de tampon 106 protoplastes 10 µg de plasmide 100 µg de « DNA carrier »

Expression Étaler les protoplastes rincés sur boite de Pétri Incuber 4-48 heures à l’obscurité Observations (Ex 495 nm / Em 515 nm)

Un transporteur du plasmalemme : AtHMA4 Témoin : GFP soluble AtHMA4::GFP Verret et al. (2004) FEBS Lett.

Un transporteur de la membrane tonoplastique: AtNRAMP3 Thomine et al. (2003) Plant J.

Isolation de protoplastes spécifiques d’une assise tissulaire Gène rapporteur GFP sous le contrôle d’un promoteur spécifique d’une assise tissulaire Prom GFP

Isolement de protoplastes de racines Tri des protoplastes exprimant la GFP par cytométrie en flux Birnbaum et Bernfey 2004 Curr. Opin. Plant Biol.

Les protoplastes tissu-spécifiques: un outil de recherche polyvalent Electrophysiologie Transcriptomique Protéomique

Exemple : transcriptome des cellules du centre quiescent Nawy et al. 2005 Plant Cell Fluorescence GFP Contre marquage IP Tri par cytométrie en flux

Hybridation sur puces à ADN Nawy et al. 2005 Plant Cell