Travail réalisé sous la direction de 28 Octobre 2005 Sophie LEDRU Relation formulation / propriétés électrochimiques dans le développement d’un biocapteur sérigraphié basé sur le transfert direct d’électrons M. Le président, Messieurs les membres du jury, mesdames et messieurs, Je vais vous présenter aujourd’hui Travail réalisé sous la direction de Mohammed BOUJTITA

Objectifs de cette étude Projet global: Préparation de biocapteurs sérigraphiés adaptés à l’analyse par injection en flux continu Questions préliminaires: Caractéristiques des encres conductrices ? Transfert direct possible? Utilisation en AIFC ? Introduction

Analyse par injection en flux continu Introduction

Analyse par injection en flux continu Technique dynamique Détection ampérométrique Avantages Analyse rapide et automatisable Appareillage simple et peu coûteux Contraintes Mise au point d’une cellule d’analyse adaptée Optimisation des méthodes d’immobilisation des composants Introduction

Plan de la présentation Les électrodes sérigraphiées Caractérisation électrochimique du transducteur Modification de l’encre par la HRP Application à la détection du L-lactate Les électrodes sérigraphiées Caractérisation électrochimique du transducteur Modification de l’encre par la HRP Application à la détection du L-lactate

La sérigraphie: principe général raclette écran substrat Porte-substrat Film imprimé cadre encre 1. Les électrodes sérigraphiées

DEK 245: Machine semi-automatique Raclette Support écran Pompe Porte-substrat 1. Les électrodes sérigraphiées

Les électrodes sérigraphiées Support Contre Électrode Électrode de Référence Électrode Indicatrice Couche Diélectrique Électrodes prêtes à l’emploi jetables Facilité d’utilisation Production à grande échelle rapide et peu coûteuse 1. Les électrodes sérigraphiées

La cellule de détection Cellule de type « wall-jet » sortie entrée 1. Les électrodes sérigraphiées

Différentes configurations possibles II III Albareda-Sirvent M., Merkoçi A., Alegret S. Sensors and Actuators B 69 (2000) 153-163 1. Les électrodes sérigraphiées

Particules conductrices Graphite Peroxydase de raifort (HRP) Encre biocomposite Particules conductrices Graphite Polymère Acétate de cellulose Encre biocomposite Solvant Cyclohexanone Enzyme Peroxydase de raifort (HRP) Impression de l’électrode en une seule étape Optimisation indispensable de la composition 1. Les électrodes sérigraphiées

Plan de la présentation Les électrodes sérigraphiées Caractérisation électrochimique du transducteur Modification de l’encre par la HRP Application à la détection du L-lactate

Préparation de l’encre conductrice Poudre de graphite + Liant = Encre (27 %) (73 %) Homogénéisation par malaxage mécanique Vérification de la rhéologie (viscosité, stabilité,…) 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

Conditions expérimentales Encres de différentes compositions: 14, 23 ou 30 % de polymère Acétate de cellulose (AC) PVC Couple Fe(CN)63-/Fe(CN)64- Solution 1 ou 2 mM dans KCl 1 mol.L-1 Voltampérométrie cyclique Spectroscopie d’impédance électrochimique 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

Étude par voltampérométrie cyclique Étude des cinétiques de transfert électronique ΔEp > 60mV Étude par voltampérométrie cyclique « Méthode de Nicholson » Nicholson R. S. Analytical Chemistry 37 (1955) 1351-1355 ΔEp v k° Ψ = γα k° (πaDo)-1/2 γ = (Do/Dr)1/2 et a = nFv/RT AC 14% 23% 30% 103*k° (cm.s-1) 1,4 ± 0, 3 0,7 ± 0,1 0,4 ± 0,1 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

Étude des cinétiques de transfert électronique « Équation de Butler-Volmer » α A Ipc = -0.027nFk°AC exp(- (αnF/RT).(Ep - Eθ’c ) Ipc = -(3,01*105)n3/2 α1/2 ADo1/2v1/2C k° 1,4 ± 0,3 1,3 ± 0,2 1,3 ± 0,3 103*k° Butler-Volmer Nicholson 30% 23% 14% AC 0,4 ± 0,1 0,7 ± 0,1 0,24±0,06 0,38±0,1 0,55±0,09 α 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

Étude des cinétiques de transfert électronique « Équation de Butler-Volmer » α A Ipc = -0.027nFk°AC exp(- (αnF/RT).(Ep - Eθ’c ) Ipc = -(3,01*105)n3/2 α1/2 ADo1/2v1/2C k° α 14% 23% 30% AC 0,55±0,09 0,38±0,10 0,24±0,06 PVC 0,23±0,08 0,13±0,05 A = 2,0 ± 0,4.10-2 cm2 k° = 1,5 ± 0,4.10-3 cm.s-1 Limitation du transfert électronique par le polymère 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

Étude morphologique de la surface de l’électrode Rugosité de la surface x 200 MEB Électrode sérigraphiée (AC 14%) Qjg Rjg Rm Qdc 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

Modélisation du comportement électrochimique de la surface Circuit proposé : Qjg Rjg Rm Qdc Rtc Qdif Rdif Masse de l’électrode Surface et solution Qdc Rtc Qdif Circuit de Randles χ² < 10-4 14% AC 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

Modélisation du comportement électrochimique de la surface Circuit proposé : Qjg Rjg Rm Qdc Rtc Qdif Rdif Masse de l’électrode Surface et solution 2. Caractérisation électrochimique du transducteur

Les électrodes sérigraphiées Plan de la présentation Les électrodes sérigraphiées Caractérisation électrochimique du transducteur Modification de l’encre par la HRP Application à la détection du L-lactate

H202 I (nA) H20 HRP(red) HRP(ox) Biocapteur de troisième génération Système étudié HRP(red) H202 H20 HRP(ox) I (nA) Biocapteur de troisième génération Transfert direct d’électrons 3. Modification de l’encre par la HRP

Préparation de l’encre modifiée = « Poudre modifiée » « Encre standard » Matériau conducteur: Carbone/graphite Récepteur(s) biologique(s): Enzyme(s) (HRP, LOD,…) + Liant polymère + 3. Modification de l’encre par la HRP

Détection de H2O2 (µmol.L-1) à 0 V vs. Ag/AgCl Utilisation en AIFC Détection de H2O2 (µmol.L-1) à 0 V vs. Ag/AgCl 200 12,5 nA 5 min 50 100 25 nA 5 min 60 30 3. Modification de l’encre par la HRP

Fonctionnement de l’électrode enzymatique 3. Modification de l’encre par la HRP

Transfert direct HRP / graphite Vitesse de balayage 20 mV/s Tampon Phosphate 0,1M pH 7,2 + 0,1M KCl E°’= -0,16 ± 0,04 V vs. Ag/AgCl Couple de la HRP Hème- Fe(III) / Hème-Fe(II) Ledru S., Boujtita M. Bioelectrochem. 2004 64 71-78 E°’= -0,17 ± 0,05 V vs. Ag/AgCl Étude similaire pour la pâte de carbone: 3. Modification de l’encre par la HRP

Mécanismes électrocatalytiques Voltamogramme hydrodynamique E / V vs. Ag/AgCl -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 - D I / nA 100 200 300 400 H2O2 H2O 2e- ks k1 3. Modification de l’encre par la HRP

Mécanismes électrocatalytiques E / V vs. Ag/AgCl -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 - D I / nA 100 200 300 400 Vitesse de balayage: 20 mV/s Tampon phosphate désoxygéné 0,1M pH 7,2 + 0,1M KCl H2O2 TP 3. Modification de l’encre par la HRP

Mécanismes électrocatalytiques Mécanisme proposé R. Huang et N. Hu Bioelectrochem., 2001, 54 75-81 H2O2 TP O2 TP 3. Modification de l’encre par la HRP

Optimisation de l’encre biocomposite 3. Modification de l’encre par la HRP

Acétate de cellulose (AC) ou PVC Influence du polymère Acétate de cellulose (AC) ou PVC 14%, 23% ou 30% 14% 23% 30% AC PVC AC sensibilité linéarité Limitation de la diffusion 3. Modification de l’encre par la HRP

Influence du solvant organique HRP Mélange au solvant Séchage Électrode de référence Adsorption sur le graphite Électrode  “ avant adsorption” Électrode “après adsorption” Malaxage avec l’huile de paraffine 81,8  8,6% 46,5  5,8 % Électrodes à pâte de carbone 100 % Influence du solvant sur l’adsorption 3. Modification de l’encre par la HRP

Modification chimique de la HRP Pourquoi ? Couplage avec la LOD (lactate oxydase) Comment ? Oxydation par le NaIO4 (Formation de fonctions aldéhydes par oxydation des résidus glucidiques) Diminution de l’activité enzymatique en solution HRP native HRP oxydée 3. Modification de l’encre par la HRP

Étude quantitative du transfert direct d’électrons Théorie de « Koutecky-Levich » adaptée à l’AIFC A. Lindgren, F.-D. Munteanu, I. G. Gazaryan, T. Ruzgas, L. Gorton, J. Electroanal. Chem., 1998, 458 113-120 Pente (Med) Pente (TDE) = HRP en TDE HRP totale TDE Médiateur Ordonnée à l’origine 1/Ilim = f (V-3/4) 1/Icin TDE Med 3. Modification de l’encre par la HRP

Formation de dimères* de la HRP avant l’adsorption Modification chimique de la HRP Hypothèses: k1(nat) = 1,3.105 s-1.mol-1.L ; k1(ox) = 0,8 . k1(nat) = 1,04.105 s-1.mol-1.L A = 0,0314 cm2 Constante de vitesse relative au TDE: ks ≈ 3 s-1 36 ± 5 58 ± 5 % de HRP en TDE HRP oxydée HRP native 47 ± 1 19 ± 1 ΓHRP totale (pmol.cm-2) 17 ± 1 11 ± 1 ΓHRP TDE (pmol.cm-2) S. Ledru, N. Ruillé, M. Boujtita, Biosens. Bioelectron., 2005, sous presse *A. M. Azevedo, V. Vojinovic, J. M. S. Cabral, T. D. Gibson, L. P. Fonseca, J. Mol. Cat. B, 2004, 28 121-128 Formation de dimères* de la HRP avant l’adsorption 3. Modification de l’encre par la HRP

Plan de la présentation Les électrodes sérigraphiées Caractérisation électrochimique du transducteur Modification de l’encre par la HRP Application à la détection du L-lactate

Électrode sérigraphiée bienzymatique Système étudié Électrode sérigraphiée bienzymatique 4. Application à la détection du L-lactate

Critères d’optimisation: Plan d’expériences Critères d’optimisation: Sensibilité Zone de linéarité Choix des paramètres à étudier: 4. Application à la détection du L-lactate

Plan d’expériences 2,4 U de LOD / mg ; 14 % d’AC; Oxydation de la HRP Essais 1 LOD 2 AC 3 Oxydation 1-2 1-3 2-3 1-2-3 Sensibilité (nA.mol.L-1) Linéarité (µmol.L-1) - + 1,30 (0,46) 8 - 76 68 (26) 0,70 (0,24) 5 - 40 35 (17) 0,73 (0,23) 5 - 73 68 (68) 4 0,62 (0,21) 7 - 117 110 (56) 5 0,87 (0,07) 10 - 180 170 (28) 6 0,88 (0,01) 17 - 147 130 (51) 7 0,27 (0,01) 30 - 195 165 (21) 8 0,37 (0,01) 20 - 250 230 (71) Effets E1 E2 E3 E12 E13 E23 E123 2,4 U de LOD / mg ; 14 % d’AC; Oxydation de la HRP négatif positif 4. Application à la détection du L-lactate

Courbe de corrélation (UV = Méthode de référence) Validation Courbe de corrélation (UV = Méthode de référence) Solutions standards y = 1,10x + 0,005 4. Application à la détection du L-lactate

Echantillons réels (UV = Méthode de référence) Validation Echantillons réels (UV = Méthode de référence) Produits laitiers (riches en lactate) 4. Application à la détection du L-lactate

Produits à base de tomates Validation Echantillons réels (UV = Méthode de référence) Produits à base de tomates (pauvres en lactate) 4. Application à la détection du L-lactate

Interférences à la détection du lactate Interférent modèle: l’acide ascorbique AL 1:0 Réduction 1:0,5 1:1 Voltamogramme hydrodynamique (Acide ascorbique ) 1:2 AA 0:1 4. Application à la détection du L-lactate

Mécanisme des interférences Oxydation catalytique AA / HRP-ES AA / ES nue TP / HRP-ES P. Ugo, V. Zangrando, L. M. Moretto, B. Brunetti, Biosens. Bioelectron., 2002, 17 479-487 S. Ledru, M. Boujtita, Bioelectrochem., 2004, 64 71-78 Mécanisme EC’ [HRP-Fe(II)](n-1)+ → [HRP-Fe(III)]n+ + e- [HRP-Fe(III)]n+ + Asc- → [HRP-Fe(II)](n-1)+ + P 4. Application à la détection du L-lactate

Cinétiques de transfert électronique influencées par le liant polymère Conclusions Cinétiques de transfert électronique influencées par le liant polymère Transfert direct d’électrons entre le graphite et la HRP immobilisée Mise en évidence du couple hème-Fe(III) / hème-Fe(II) Augmentation de la quantité de HRP en TDE par oxydation Influence des composants de l’encre sur les propriétés du biocapteur Limitation de la diffusion du substrat par le polymère Désorption de la HRP due à la présence d’un solvant organique Application à la préparation d’une électrode bienzymatique Méthode validée pour les produits laitiers Problème d’interférences avec l’acide ascorbique pour les produits pauvres en L-lactate

Perspectives Poursuivre les études en impédance Caractériser la rhéologie des encres Etudier l’effet de l’oxydation sur l’activité de la HRP Comprendre l’influence du solvant Augmenter la stabilité de stockage des électrodes modifiées par la HRP Résoudre le problème des interférences Adapter le procédé à la détection d’autres analytes

Dr F. Fleury (Université de Nantes) Remerciements Dr F. Fleury (Université de Nantes) Dr C. Cougnon (Université du Maine) N. Ruillé F. Ghamouss

Merci pour votre attention