APPAREIL de GOLGI HISTORIQUE La Valette St-George 1865 Golgi 1896-1910 (PN 1906 avec Cajal) Cajal 1910-1920 Dalton & Felix (M.E.) 1954 DÉFINITION Ensemble d’éléments complexes, les dictyosomes, reliés entre eux par des systèmes tubulo-vésiculaires. Un dictyosome est constitué par un empilement de saccules clos lisses, inclus dans une matrice protéique (les GMP Golgi Matrix Protein). Ensemble responsable de phénomènes - de GLYCOSYLATIONS, - de SULFATATIONS, - d’ADRESSAGES de VÉSICULES ASPECTS en MICROSCOPIE PHOTONIQUE

Dessins originaux de Camillo Golgi de « l’apparato reticolare interno » tel qu’il l’observa dans un neurone de chat (1898)

La DIFFICULTÉ MAJEURE : Faire coïncider ces images avec…

Ça … Microscopie électronique d’un appareil de Golgi (cellule C thyroïdienne)

APPAREIL de GOLGI

APPAREIL de GOLGI DICTYOSOME VESICULES SACCULES GOLGIENS TUBULES

ORGANISATION d’un DICTYOSOME RÉSEAU TRANS-GOLGIEN GOLGI TRANS GOLGI MEDIAN GOLGI CIS Limites… Structure… ERGIC REG MICROTUBULES Sacs maintenus ensembles par : - les microtubules protéines CLIMP, - des protéines membranaires périphériques diverses: GRASP, GMPs, etc. : les golgines Toutes protéines phosphorylables par kinases (cdk)

Ancienne question toujours sans réponse définitive : GOLGI & TRANFERTS Ancienne question toujours sans réponse définitive : Comment les produits sont-ils déplacés dans les saccules golgiens ? 1ere hypothèse : Les saccules se déplacent avec leur contenu par formation de nouveaux saccules à la face cis Schéma des saccules dynamiques Hypothèse retenue jusqu’aux années 80 puis rejetée car : 1 - un saccule spécifique a toujours la même composition 2 - présente toujours les même enzymes marqueuses membranaires. 2ème hypothèse : Le contenu des saccules se déplace dans les petites vésicules péri-golgiennes sans que les enzymes marqueuses ne quittent leurs saccules respectifs qui restent stables. Schéma de l’immobilité des saccules Hypothèse acceptée jusqu’aux années 2001, puis battue en brèche car : - Les vésicules péri-golgiennes ne semblent pas contenir de matériel de sécrétion. On y met en évidence diverses enzymes marqueuses. Mais comment sont transférées les grosses protéines ? 3ème hypothèse : Les saccules se déplacent avec leur contenu par formation de nouveaux saccules à la face cis mais avec transferts rétrogrades des protéines marqueuses par de petites vésicules. Hypothèse actuelle…

2ème hypothèse : compartiments stables mais déplacements vésiculaires GOLGI & TRANFERTS 2ème hypothèse : compartiments stables mais déplacements vésiculaires En réalité : on n’observe pas de matériel de secrétion dans les petites vésicules… Comment de plus transférer les grosses protéines dans de petites vésicules…

Ancienne question toujours sans réponse définitive : GOLGI & TRANFERTS Ancienne question toujours sans réponse définitive : Comment les produits sont-ils déplacés dans les saccules golgiens ? 1ere hypothèse : Les saccules se déplacent avec leur contenu par formation de nouveaux saccules à la face cis Schéma des saccules dynamiques Hypothèse retenue jusqu’aux années 80 puis rejetée car : 1 - un saccule spécifique a toujours la même composition 2 - présente toujours les même enzymes marqueuses membranaires. 2ème hypothèse : Le contenu des saccules se déplace dans les petites vésicules péri-golgiennes sans que les enzymes marqueuses ne quittent leurs saccules respectifs qui restent stables. Schéma de l’immobilité des saccules Hypothèse acceptée jusqu’aux années 2001, battue en brèche maintenant car : - Les vésicules péri-golgiennes ne semblent pas contenir de matériel de sécrétion. On y met en évidence diverses enzymes marqueuses. Mais comment sont transférées les grosses protéines ? 3ème hypothèse : Les saccules se déplacent avec leur contenu par formation de nouveaux saccules à la face cis mais avec transfert rétrograde des protéines marqueuses par de petites vésicules. Hypothèse actuelle…

GOLGI & TRANFERTS 3ème hypothèse : Déplacement des saccules retour des protéines résidentes par vésicules

LES TRANSFERTS GOLGIENS Soluble N ethylmaleimide Attachment protein REceptor REG COP II Sar1 t-SNARE :Syntaxine 5 ERGIC phosphorylable COP I/Rab1 Giantine p115 GM130 GRASPs Complexe d’ancrage Golgi Cis Golgi médian Golgi ReAssembly Stacking Protein COP I/Arf1 ? COP I/Arf1 Golgi Trans Réseau Trans Golgi Clathrine Grains de sécrétion Lysosomes

- + + pH Dynéine-dynactine 7 5,5 COPII Sar1 Cis-Golgi Golgi médian Trans-Golgi ERGIC Endoplasmic Reticulum Golgi Intermediate Compartment Existence réelle? COPI Les petites vésicules tapissées par COPII ont un diamètre de 60 à 80 nm, beaucoup trop petit pour pouvoir accueillir certaines grosses ou longues protéines rigides comme par exemple les molécules de collagène (300 nm de long…) Arf1 + - Kinésine REG Protéine sécrétoire Récepteur KDEL Protéine résidente avec séquence KDEL

dans le complexe d’ancrage LES TRANSFERTS GOLGIENS par diminution de la température, par blocage de Arf1 par destruction des MT L’appareil de Golgi est une structure dynamique : 1 – Le blocage des transferts à partir du REG DÉSINTÉGRATION 2 – La phosphorylation de GM130 DÉSINTÉGRATION GM130 est associée à Giantine p115 dans le complexe d’ancrage Survient normalement lors de la prophase Les rétro-transferts vers le REG : Sar1: petite GTPase fondamentalement concernée par le recrutement de protéines du manteau à partir du cytoplasme situé au voisinage des sites d’exportation du REG vers le Golgi Arf1 voit son fonctionnement bloqué par la bréfeldine A : cet antibiotique extrait d’un champignon bloque en effet la protéine GEP permettant l’échange du GDP contre du GTP sur Arf1. Il s’en suit une désintégration de l’appareil de Golgi 1 – par l’intermédiaire de vésicules type COP I, 2 – intervention de la petite protéine Rab1 et de sa GAP, 3 – concernent les protéines solubles résidentes du REG à motif KDEL 4 – grâce à un récepteur membranaire spécifique (ERD2 ou KDEL-R) 5 – mécanismes de reconnaissance du complexe ERD2+KDEL inconnus D’autres systèmes de rétro-transferts sont suspectés mais non encore identifiés

SECRÉTION CONSTITUTIVE RÉTICULUM ENDOPLASMIQUE COP2 Sar1 COP1 Arf1 APPAREIL de GOLGI Clathrine COP1 Clathrine ? LYSOSOMES SECRÉTION CONSTITUTIVE SECRÉTION RÉGULÉE ENDOSOMES TARDIFS Cavéolines VÉSICULES SECRÉTOIRES ENDOSOMES PRÉCOCES Clathrine ESPACE EXTRA-CELLULAIRE

APPAREIL de GOLGI : FONCTIONS LES GLYCOSYLATIONS SULFATATIONS PHOSPHORYLATIONS SYNTHÈSES LIPIDIQUES LES RAPPORTS AVEC LE RÉSEAU TRANS-GOLGIEN ADRESSAGE des PRODUITS ÉLABORÉS Grains de sécrétion & lysosomes Excrétion constitutive versus Excrétion régulée CLIVAGES PROTÉIQUES

N-ACÉTYL-GALACTOSAMINE LES GLYCOSYLATIONS Beaucoup plus complexes que celles du REG ERGIC FACE CIS GOLGI MEDIAN FACE TRANS R.T.G. REG Sont séquentielles : localisation spécifique de chaque enzyme. Présence de transporteurs à ces différents sucres dans les membranes. RÔLES Indispensables à l’excrétion : - Contrôle de qualité - Signal de sortie au pôle apical dans la cellule polarisée ADDITION N-ACÉTYL-GALACTOSAMINE Modalité de protection contre diverses protéases: le glycocalix les mucus ADDITION GALACTOSE ACIDE SIALIQUE Système de reconnaissance : - penser aux groupes sanguins… ADDITION ACIDE SIALIQUE Formation des - protéoglycanes - glycoprotéines

FONCTIONS de l’APPAREIL de GOLGI Osmium PHOSPHORYLATION MANNOSES LYSOSOMAUX N-acétyl glucosamine phosphotransférase N-acétyl glucosaminidase ADDITION N-ACÉTYL GALACTOSAMINE Thiamine pyrophosphatase Sulfotransférases Galactosyl transférases Sialyl transférases ADDITION GALACTOSE ACIDE SIALIQUE ACIDIFICATION DES LUMIÈRES par ATPase ADDITION ACIDE SIALIQUE FORMATION DES LYSOSOMES RETOUR DU MATÉRIEL D’ENDOCYTOSE CLIVAGES PROTÉIQUES Les CONVERTASES EXCRÉTION RÉGULÉE EXCRÉTION CONSTITUTIVE

Injection de Rappel : L’apparition d’un bruit de fond, de murmures diffus Cours considéré comme fait, supposé connu et pouvant faire l’objet de diverses QCM lors du concours… IL N’Y AURA AUCUN AUTRE AVERTISSEMENT !!!

De type « P » (plasmique): Les ATPases En partie responsable de la polarité membranaire 1 - ATPases IONIQUES : Na+/K+ ATPase : a2b2, a à 7 traversées, b à une seule Ubiquitaire, consomme 1/3 de l’ATP produit, expulse 3 Na+ contre 2 K+ Membranes plasmique & réticulaires Ca++ ATPase : Vésicules de sécrétion, endosomes tardifs, réseau trans-golgien Membranes mitochondriales internes, membranes bactériennes… H+ ATPase : H+/K+ ATPase : Membrane plasmique cellule bordante stomacale De type « P » (plasmique): De type « V » (vacuolaire) : 2 - ATPases ABC (ATP Binding Cassette) Membrane plasmique. Divers métabolites, les sels biliaires, les xénobiotiques. Protéines MDR (MultiDrug Resistance), MRP (Multidrug resistance Related Protein), CQR Membrane plasmique. Transfert du chlore et mucoviscidose Protéine CFTR : Transfert des antigènes générés dans le cytoplasme vers les membranes réticulaires avant délivrance à la membrane plasmique Protéines TAPs (Transport associated Antigene Processing) PMP 70 : Peroxysomes Proteines APC (acides Aminés, Polyamines, Cations) : lysosomes 3 - ATPases AAA (ATPases associées à diverses activités) Protéolyse dans le protéasome, Désassemblage tSNARE vSNARE (NSF) Désassemblage fuseau mitotique en fin de mitose

Sites de fixation de l’ATP Schéma d’une ATPase vacuolaire Schéma d’une ATPase ABC A B H G C D F a e Cytoplasme Sites de fixation de l’ATP « cassette » Matrice

La plaque tournante du trafic vésiculaire car RÉSEAU TRANS-GOLGI La plaque tournante du trafic vésiculaire car - Recueil des vésicules d’endocytose, - Émission des lysosomes, - Émission des grains de secrétion : secrétion régulée, vers le pôle excrétoire - Émission de vésicules diverses secrétion non régulée, vers toute la membrane plasmique vers divers systèmes membranaires 1 - Recueil des vésicules d’ENDOCYTOSE : ACTINE DÉPENDANTE : Amibe, cellules thyroïdiennes stimulées, cellules musculaires lisses, cellules adipeuses, fibroblastes Macropinocytose + CLATHRINE DÉPENDANTE Les plateaux et les puits bordés. Les vésicules bordées.  Distribution finale vers les lysosomes LES CAVEOLAE  LES RAFTS, VÉSICULES LISSES, PHAGOSOMES

LES VÉSICULES à CLATHRINE Schéma d’une molécule de clathrine (triskel) composée par 3 chaînes lourdes et 3 chaînes légères Géométrisation de l’arrangement des triskels de clathrine pour former une vésicule bordée Invagination d’un plateau bordé formant un puits bordé. Vésicule bordée

Formation d’une vésicule à clathrine

FORMATION d’UNE VÉSICULE à CLATHRINE Mb TGN ou Mb plasmique FORMATION d’UNE VÉSICULE à CLATHRINE Peut être remplacée par un complexe ligand-récepteur Triskel de clathrine Petite Protéine G Protéine AP Protéine destinée à l’excrétion Signal di-leucine de sortie Protéine accessoire régulant la fixation de la clathrine ATTENTION : les petites protéines G et les protéines d’adaptation sont spécifiques de la localisation

LES VÉSICULES à CLATHRINE Attention : schémas précédents un peu simplistes N’ont pas été représentées : certaines petites protéines G les v-SNAREs Origine de ces vésicules : Membrane plasmique Membranes TGN lysosomes & grains de sécrétion Intervention de la dynamine dans l’isolement de ces vésicules bordées Protéine GTPasique PRODUITS INCORPORÉS : Hormones : Insuline, Glucagon, Prolactine Calcitonine, TSH, GH, LH Facteurs de croissance : NGF, EGF, PDGF, Interférons Toxines : diphtérique, anthrax, de Pseudomonas, botulique et tétanique Virus : grippal, HIV, forêt de Semliki, stomatite vésiculaire … Protéines plasmatiques de transport : transferrine, transcobolamine, LDL Immunoglobulines Tous ces composés sont incorporés après fixation sur un récepteur

La plaque tournante du trafic vésiculaire : RÉSEAU TRANS-GOLGI La plaque tournante du trafic vésiculaire : 1 - Recueil des vésicules d’ENDOCYTOSE : ACTINE DÉPENDANTE : Amibe, cellules thyroïdiennes stimulées, cellules musculaires lisses, cellules adipeuses, fibroblastes Macropinocytose CLATHRINE DÉPENDANTE Les plateaux et les puits bordés. Les vésicules bordées. Distribution finale vers les lysosomes LES CAVEOLAE

Cryo-décapage après ultracongélation : membrane plasmique, versant cytoplasmique

LES CAVEOLAE Petites dépressions en forme d’W renversé sur la membrane plasmique Ubiquitaires mais +++ dans adipocytes, fibroblastes, cellules et fibres musculaires, endothélium vasculaire, pneumocytes, cellules épithéliales. Cholestérol et sphingolipides, protéines ancrées sur des glycolipides (prot. à ancre GPI) protéines spécifiques, les cavéolines Riches en Les CAVÉOLINES : 3 isoformes (18 à 24 kDa) : cavéolines 1 & 2 ubiquitaires cavéoline 3 uniquement musculaires en forme d’épingle à cheveu avec 2 extrémités cytoplasmiques capables de fixer les MF d’actine par intermédiaire de la filamine fixent le cholestérol libres dans le cytoplasme, peuvent transférer des stéroïdes Sont considérées comme des protéines à manteau Les « RAFTS » : domaines particuliers de diverses membranes (plasmique, R.E. Golgi) enrichis en cholestérol et glycolipides mais sans cavéoline à ce niveau, membrane plus épaisse. Une trentaine de récepteurs divers sont associés à ces rafts ou caveolae Toxines cholérique, botulique, tétanique, HDL, SV40, Ig, Les caveolae ne distribuent pas leurs ligands aux lysosomes, participent aux phénomènes de transcytose, peuvent fusionner directement avec le RE, et….

LE COMPARTIMENT ENDOSOMAL Définition : Ensemble de structures tubulo-vésiculaires originaire de la membrane plasmique. Compartiment progressivement acidifié par des v-ATPases Origine et filiation Plateaux bordés vésicules à clathrine Caveolae Vésicules lisses Radeaux lipidiques Macropinocytose macropinosome Phagocytose phagosome Vésicules lisses Endosomes précoces 7 Endosomes précoces de triage pH Lysosomes 5 Endosomes tardifs de triage Corps multivésiculaires Corps résiduels

Corps multivésiculaires 7,2 LE COMPARTIMENT ENDOSOMAL C.M.V. : Corps multivésiculaires pH 6 5 4 Lysosomes Corps résiduels Endosomes précoces Endosomes « moyens » Endosomes « tardifs» (C.M.V.) Rab5 Rab4 Rab7 Rab7 ATP H+ ADP Endosomes de recyclage GTP Rab7 Rab11 PETITES PROTEINES G GDP Enzymes lysosomales TGN

Recyclage des récepteurs De l’importance de la formation des corps multivésiculaires Endosome précoce Recyclage des récepteurs non ubiquitinylés Endosome moyen Si ce phénomène n’existait pas, la destruction des récepteurs ne pourrait être que partielle, laissant les segments intra- cytoplasmiques non détruits Formation d’invaginations membranaires Lysosome Corps multivésiculaire Ubiquitine Lipases Protéases Récepteurs Ligand Ajout de diverses protéines : membranaires : navettes des matériaux dégradés, ajout pompe protons spécifique, - solubles : enzymes lysosomales

CORPS MULTIVÉSICULAIRES

La plaque tournante du trafic vésiculaire : RÉSEAU TRANS-GOLGI La plaque tournante du trafic vésiculaire : 1 - Recueil des vésicules d’ENDOCYTOSE : ACTINE DÉPENDANTE : Amibe, cellules thyroïdiennes stimulées, cellules musculaires lisses, cellules adipeuses, fibroblastes Macropinocytose CLATHRINE DÉPENDANTE Les plateaux et les puits bordés. Les vésicules bordées. Distribution finale vers les lysosomes LES CAVEOLAE LES RAFTS, VÉSICULES LISSES, PHAGOSOMES 2 – Emission de VÉSICULES d’EXOCYTOSE :

RÉSEAU TRANS-GOLGI EXOCYTOSE D ? E D N D D O ? C Y T D O S E D pH 6,5 5,5 5 7 Maturation granulaire EXOCYTOSE ATP ADP H+ D H+ CLATHRINE : Grains de sécrétion Sécrétion régulée ? Rétrotransferts COP I vers Golgi vers RE COP I Sécrétion constitutive Plateaux & Puits Bordés (Clathrine) E Endosomes D N D D O CLATHRINE ? Lysosomes C Y T D CAVÉOLINE Divers récepteurs O S Rafts & cavéoles E D = Dynamine

EXCRÉTION CONSTITUTIVE EXCRÉTION RÉGULÉE EXCRÉTION CONSTITUTIVE Toujours au même pôle cellulaire Sous l’influence d’un signal Est précédée de la « maturation » du granule : action des convertases départ pompes à protons fusions granulaires éventuelles Renouvellement de la membrane plasmique du pôle excrétoire Vers toute la membrane plasmique Continue Utilise des tSNAREs spécifiques Renouvellement des composants protéiques de la membrane plasmique Ne pas oublier : la membrane plasmique n’a pas partout la même composition Dans les cellules épithéliales, les complexes de jonction constituent une barrière à la diffusion des protéines dans le plan membranaire. Question : le contrôle de cette différence….

TRAFIC VÉSICULAIRE COMPARTIMENT INTERMEDIAIRE

L’EXOCYTOSE Mécanismes par lesquels des produits d’élaboration stockés dans une vésicule sont expulsés hors de la cellule. Mécanismes nécessitant : - une reconnaissance entre vésicule et membrane plasmique, - un accolement des systèmes membranaires - une fusion de ces membranes. Interviennent fondamentalement 4 familles de protéines : - Les protéines SNAREs (Soluble NSF Attachment protein REceptor) les t-SNAREs sur la membrane plasmique, (t pour « target ») les v-SNAREs sur les membranes vésiculaires (v pour « vesicular ».) ces deux protéines étant complémentaires l’une de l’autre - De petites protéines G : les protéines Rab spécifiquement localisées dans la cellule, présentant des spécificités pour certaines vésicules, possédant des « récepteurs » spécifiques sur certaines membranes. - Le complexe dit NSF (ATPase AAA) - Des protéines de fusion.

Une vingtaine de SNAREs sont actuellement connues Les protéines SNAREs Une vingtaine de SNAREs sont actuellement connues protéines transmembranaires caractérisée par des domaines hélicoïdaux cytoplasmiques caractéristiques existent sous la forme de couples complémentaires: formation de complexes tSNARE-vSNARE stables v-SNARE t-SNARE Membrane plasmique Protéines de fusion Rabx Rabx-R Rabx-GTP Rabx-GDP GEP

Modalités de retour vers le compartiment d’origine ??? Protéine SNAP: Soluble NSF Attachment Protein NSF : N ethylmaleimide Sensitive Factor (ATPase AAA)

Ce qui est fondamental : - les t-SNAREs - les v-SNAREs Ces protéines concourrent à empêcher des fusions vésiculaires entre deux systèmes membranaires non apparentés en coopération avec les protéines Rab. Existent sur tous les systèmes membranaires vésiculaires et plasmique. Physiopathologie de certaines maladies cibles de certaines toxines - Les protéines de fusion : mal connues actuellement chez les Eucaryotes mais mieux connues chez certains virus : elles permettent l’entrée de ce dernier dans la cellule-cible. - Les petites protéines G de la famille Rab : elles assurent en partie la spécificité des fusions entre 2 membranes spécificité étant aussi assurée par le complexe t-SNARE et v-SNARE Rab1 : Golgi & RE Rab2 : cis Golgi Rab3 : vésicules de secrétion Rab4 : endosomes précoces Rab7 endosomes tardifs Rab8 : excrétion constitutive

ENDOPEPTIDASES pouvant cliver Toxine botulique : Toxine tétanique : SNAP b Syntaxine synaptobrévines ENDOPEPTIDASES pouvant cliver Toxine botulique : tSNAREs de la membrane présynaptique Toxines botulique et tétanique s’attaquant à des synapses différentes signes cliniques différents Métalloprotéases à zinc bi caténaires (une chaîne lourde, une chaîne légère reliée par un pont disulfure) endocytées par les plateaux bordés, les caveolae, chaîne légère transloquée hors du compartiment endosomal clive alors une des trois protéines Clostridium botulinum, anaérobie strict Incubation : 5 à 30 heures Douleurs abdominales, vomissements Paralysies flasques d’abord oculaires pouvant se généraliser (T.D. puis membres) Paralysie respiratoire mort en 2 à 6 jours Plectridium tetani, anaérobie strict Incubation : 5 à 8 jours Contractures douloureuses des muscles : trismus : contracture des masséters opisthotonos: contractures généralisées Paralysie des muscles respiratoires mort en 2 à 6 jours

Ce qui est fondamental : - les t-SNAREs - les v-SNAREs Ces protéines concourrent à empêcher des fusions vésiculaires entre deux systèmes membranaires non apparentés en coopération avec les protéines Rab. Existent sur tous les systèmes membranaires vésiculaires et plasmique. Physiopathologie de certaines maladies cibles de certaines toxines - Les protéines de fusion : mal connues actuellement chez les Eucaryotes mais mieux connues chez certains virus : elles permettent l’entrée de ce dernier dans la cellule-cible. - Les petites protéines G de la famille Rab : elles assurent en partie la spécificité des fusions entre 2 membranes spécificité étant aussi assurée par le complexe t-SNARE et v-SNARE Rab1 : Golgi & RE Rab2 : cis Golgi Rab3 : vésicules de secrétion Rab4 : endosomes précoces Rab7 endosomes tardifs Rab8 : excrétion constitutive

En route vers les LYSOSOMES