PERSPECTIVES D’AMELIORATION POUR LA PRISE EN CHARGE DE LA FEMME RHD NEGATIVE Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

INTRODUCTION INCOMPATIBILITES RHD FOETO-MATERNELLES EN FRANCE INCIDENCE estimée (pour 1000 naissances) MORTALITE estimée & MORBIDITE SEVERE 1966 5 à 6 ‰ ≥ 12% des cas Prévention Rh ciblée Baisse de l’indice de fécondité Dépistage biologique Médecine néonatale Échographie fœtale Transfusions fœtales IV 2006 ≈ 0,8 ‰ ≈ 4% des cas Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Efficacité Taux cumulés d ’immunisation anti-D en fin de grossesses chez la femme Rh négatif Spontané Après Ig Rh post partum seulement + Ig Rh ante partum systématique Nº1 Nº2 Nº3 Nº4 Rang de grossesse Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Le Principe Actif Basée sur l’utilisation d’immunoglobulines polyclonales anti-D (IgRh) : Seule source : fractionnement de plasma humain, contenant un titre élevé d’anticorps dirigés contre l’antigène RhD Plasma humain : fourni par des donneurs RH-, hyperimmunisés par injections répétées de globules rouges RH+(rémunérés) 97 % de plasmas collectés aux Etats-Unis Spécialité commercialisée en France : RHOPHYLACR (LFB : laboratoire Français du fractionnement et des Biotechnologies) Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Mécanismes possibles 3 MECANISMES POSSIBLES : Tous dépendent de la formation d’un Immun-complexe I- Masquage des épitopes RhD par saturation des sites antigéniques RhD. III- Destruction antigénique par clairance macrophagique très rapide des globules rouges RhD+ IgG anti-D Antigène RhD II- Inhibition des lymphocytes B spécifiques par interaction entre le RFcgIIb lymphocytaire et le segment Fc des IgG anti-D. Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Inconvénients Médicaments dérivés du sang : - Mesures maximales en matière de sécurité virale et autres agents infectieux (pour octroi d’AMM par Afssaps)… néanmoins toujours possibilité de transmission d’agents non répertoriés - Règles de traçabilité - Information systématique des patientes concernant un médicament dérivé du sang (nature des produits utilisés, risques liés à leur utilisation, mesures de sécurité prises pour la fabrication des produits) Liés au mode de préparation de ces Ig anti-D : Problème d’approvisionnement en plasmas hyperimmuns Problème d’ordre éthique liés à l’immunisation de sujets volontaires sains Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Perspectives Actuellement l’immunoprophylaxie RH ante-natale concerne toutes les femmes RH- bien que 30 à 40 % d’entre elles portent un enfant RH- 1- Ig MONOCLONALES Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Production d’Ig MONOCLONALES Transformation de lymphocytes humains par l’EBV Ac 1 clonage sélection EBV Ac 2 cellules mononucléées lymphocytes B transformés lignées B Anticorps monoclonaux humains Biologie moléculaire : Ac Mo humains recombinants Souris humanisées : greffe des loci IgG humains Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Production d’Anti-D recombinants ADNc Lymphocytes B (EBV) PCR L H Vecteur d’expression Transfection CHO Lignées cellulaires : BHK NS0… anticorps recombinants ARN Clonage PRINCIPE Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Sélection des Ig MONOCLONALES 1- AFFINITE +++ pour l’antigène RhD (rendement de fixation, saturation des épitopes) CANDIDAT IDEAL 2-SPECIFICITE+++ pas de réaction croisée avec une autre cible antigénique 3- SENSIBILITE+++ reconnaissance d’un maximum de variant 4- PHARMACOCINETIQUE équivalent à une IgG polyclonale 5- FORT POTENTIEL d’activation des récepteurs Fcg : Importance de la glycosylation post-traductionnelle Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Sélection des Ig MONOCLONALES TESTS FONCTIONNELS Pour mesurer la fixation des IgG anti-D aux différents récepteurs Fc Mesure ADCC (antibody/dependent/cellular/cytotoxicity), permet la mesure des interactions avec le récepteur FcgRIIIa Fc RI g Fc RII IgG g Lymphocyte Ac Lyse Fc RIII g Ag Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Test de clairance des hématies 10 mg IgG polyclonales Volontaire RhD- injection de 1,5 ml de GR RhD+ marqués au Cr51 Injection de 10 mg de poly D H0 Injection de 100 mg de poly D H50 T1/2 : 18h pour 10 mg T1/2: 3h pour 100 mg 100 mg IgG monoclonales Volontaire RhD- injection de 1,3 ml de GR RhD+ marqués au Cr51 Injection de 871 mg de MONO-D T1/2: 13,7 jours Etude Yves Brossard CNRHP Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS 1ers anticorps Test de survie des GRs (1996) AD1+AD3 Poly-D : n=4 AD1+AD3: n=8 Etude clinique : sujets Rh-, hématies Rh+ Cr51, Ig polyclonale anti-D WinRh0, Ac monoclonaux humains AD1+AD3 (V:V) AD1+AD3 mAbs Poly-D Time AD1+AD3 : clairance moins rapide et incomplète par rapport à celle obtenue avec les Ig polyclonales anti-D Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Clairance des GRs marqués au 51Cr R297 anticorps monoclonal du LFB Excellente clairance en comparaison avec un anti-D polyclonal I.V. injection of autologous 51Cr RhD+ RBC into male volunteers: - 51Cr RBC only, n=2 - 51Cr RBC 25% saturation with marketed Poly-D antibodies , n=7 Emabling® R297 anti-RhD mAb , n=7 20 40 60 80 100 120 0.01 0.1 1 10 Time (h) RhD+ RBC (% of 15 min 51Cr value) Marketed poly-D 51Cr RBC only #1 51Cr RBC only #2 Marketed poly-D #3 R297 #8 R297 #9 R297 #10 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Ig MONOCLONALES Plusieurs anticorps monoclonaux sont en cours de développement et ont été évalués en clinique : - Rheseclone : Russie , produit par une lignée lymphoblastoïde EBV, aucune donnée disponible - BRAD-3 (IgG3) et BRAD-5 (IgG1) Royaume Uni par BPL (Bioproduct Labratories) seuls ou en association : capable d’induire une immunosupression chez des sujets RhD- ayant reçu des GR RhD+, mais clairance des hématies moins rapide que les Ig polyclonales - MonoRh0 : Suisse, ZLB-CSL : testé chez volontaire Rh négatif immunosupression bien clairance d’hématies RhD+ injecté beaucoup plus faible qu’avec le RhophylacR - R597 : France, LFB, sélection d’ un anticorps humain monoclonal recombinant sur la base de son activité fonctionnelle : Forte liaison aux récepteurs FcgRIII, activation des cellules NK avec lyse des hématies RhD+, clairance d’hématies RhD+ aussi rapide que RhophylacR Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Ig MONOCLONALES INCONVENIENTS : Problème des résistances éventuelles : développement d’anti-idiotype Pour prouver efficacité et pour envisager de remplacer les IgG polyclonales : besoin d’une évaluation à grande échelle Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

IMMUNOPROPHYLAXIE RHESUS Perspectives Actuellement l’immunoprophylaxie RH ante-natale concerne toutes les femmes RH- bien que 30 à 40 % d’entre elles portent un enfant RH- 2- GENOTYPAGE Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LE COMPLEXE Rh Protéine RHD : protéine transmembranaire du Globule Rouge 15000 sites par GR RhD+ Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LA PROTEINE RHD Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL LE LOCUS RH Isolement et séquençage du gène RHD par l’équipe française INSERM U76, Y. Colin et al. Genetic Basis of the RhD-Positive and RhD-Negative Blood Group Polymorphism as determined by Southern Analysis . Blood 1991 ; 28 : 2747-52 Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL Liquide amniotique - Plasma I - Génotypage RHD fœtal réalisable sur l’ADN des cellules amniotiques (année 90) P.R. BENNET et al. N.eng.J.Med. 1993; 329:607-610 J.T. AUBIN et al. Br J Haematol 1997 ; 98 (2) : 356-364. - Diagnostic invasif II – Génotype RHD fœtal à partir du sang des femmes enceintes RhD – Suite à la découverte de la présence d’ADN fœtal dans le plasma des femmes enceintes ( 1 à 6 % d’ADN d’origine fœtale sous forme acellulaire) LO Y.M. et al. Am J Hum Genet, 1998, 62 : 768-775. - Diagnostic non invasif Limite du test : femme ne doit pas posséder dans leur génome des séquences non exprimées du gène RHD. Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL ADN fœtal dans le plasma maternel Isolement Rapide, simple Persistance in vivo Demi-vie < 1 heure Quantité de Génomes (par ml de plasma maternel) 25 (3 à 70) à 15 S.A. 290 (77 à 769) à terme ADN fœtal dans le plasma Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL INTERET I- GROSSESSES AVEC IMMUNISATION ANTI-D Diagnostic d’Incompatibilité foeto-maternelle RhD (environ 1000 cas / an en France avec 90% de fœtus Rh+) II- GROSSESSES SANS IMMUNISATION ANTI-D : Cibler l’immunoprophylaxie Rh anténatale et les RAI itératives aux seules femmes Rh - avec fœtus Rh+ (environ 120.000 femmes / an en France avec 65% de fœtus RH+) Validation du génotypage non invasif par une étude portant sur 851 femmes enceintes au CNRHP C. Rouillac-Le Sciellour et all Large scale Pre-Diagnosis study of Fetal RHD Genotyping by PCR on plasma DNA from RhD-negative Pregnant women. Mol Diagn 2004 ; 8; 23-31. Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL EN PRATIQUE Sang maternel collecté sur EDTA ( 5 à 7 ml), 48h max entre prélèvement et réception au laboratoire Centrifugation puis décantation plasma Extraction de l’ADN plasmatique Amplification par PCR des séquences spécifiques du gène RHD : - exon 7 ( plus spécifique mais moins sensible) - exon 10 (plus sensible mais moins spécifique) Les 2 amplifications distinctes permettant d’augmenter la sensibilité du test et détecter un maximum de variant du système RH SI FŒTUS RH- REPETER LE TEST SUR UN SECOND PRELEVEMENT Concentration plus élevée d’ADN fœtal 2) Rattraper une erreur d’étiquetage 3) Rattraper un croisement per-analytique des échantillons Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL EVOLUTION Coopération RECHERCHE –INDUSTRIE (INSERM – INTS- CNRHP - J.BOY) Trousse développée en 2006-2007 Kit de 1ère génération pour PCR en Temps Réel avec reporter fluorescent.Marquage CE obtenu en JUIN 2007 Cibles: exons X et VII (amorces CNRHP)Sonde Taqman Projet STIC 2007-2008: Génotypage RHD fœtal non invasif systématique Paris-CNRHP / Marseille / Lille / Poissy / Nantes  OBJECTIFS MEDICO-ECONOMIQUES: -Diminution des injections inutiles d’IgRH et des RAI chez les femmes avec fœtus Rh négatif ? - Amélioration de la compliance à la prévention Rh anténatale, ciblée ou systématique chez les femmes avec fœtus Rh positif ? - Evaluer la faisabilité et le coût d’un programme de Génotypage fœtal RH systématique dans le cadre actuel du suivi prénatal en France. Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine

LE GENOTYPAGE RHD FŒTAL REGLEMENTATION Depuis le décret 1661 du 22 décembre 2006 le génotypage fœtal RHD peut être effectué uniquement : Dans un laboratoire autorisé par l’Agence Régionale d’Hospitalisation, après avis de l’Agence de Biomédecine. Par des biologistes agrées par l’Agence de Biomédecine. Agnès Mailloux, CNRHP, Hôpital St Antoine