Dosages immunologiques

Plan Historique Classification des réactions antigène/anticorps Définition de la liaison primaire Présentation de la méthode de classement Visualisation directe de la réaction primaire Méthodes utilisant la précipitation des complexes Ag/Ac Méthodes fluorométriques Agglutination Néphélémétrie et turbidimétrie

Plan Visualisation indirecte de la liaison anticorps/antigène Les différents marqueurs radioactifs Dosage RIA radio immunologique Les marqueurs fluorescents Les marqueurs enzymatiques Différents types de dosages à partir des différentes propriétés des marqueurs Dosages immuno enzymatiques EIA

Historique 1959 Premiers dosages RIA endocrinologie dosage de très faibles concentrations d’hormones dans le sang. Anticorps polyclonaux. Marqueurs radio isotopiques I125, I131 , H3. Méthodes par compétition, réalisées dans des tubes à essais. Phase homogène Entièrement manuel.

Historique (2) Durée de 24 à 48 h. Coût élevé. Un technicien réalise une centaine d’échantillons par jour. Traitement des déchets. Sensibilité femtomoles (10-15 M)

Historique (3) 1970 Immuno-enzymologie Avraméas, Engvall, Perlman Marqueurs non isotopiques : peroxidase, phosphatase alcaline Techniques immunométriques. Début d’automatisation avec l’arrivée des microprocesseurs.

Historique (4) 1975 Anticorps monoclonaux Khöler et Milstein Technologie des hybridomes Supplantation des techniques immunométriques par les techniques sandwich. Nouveaux supports : billes, plaques de microtitration. Simplification des dosages

Historique (5) 1980 Nouveaux marqueurs Luminescents : luminol Fluorescent Amplification enzymatique Décentralisation des dosages immunologiques.

Historique (6) 1990 Automates et home test Automatisation des techniques pour réaliser de la routine. Micro particules magnétiques. Durée 20 minutes Sensibilité 10-18 moles Sondes génomiques, techniques PCR.

Historique (7) 1995 Et après… Impact de la biologie moléculaire : banques d’anticorps. Réactifs recombinants : caractéristiques parfaitement contrôlées. Dosage par sonde génomique par les labos de quartier Immuno PCR Essor des biocapteurs ....

Classification Critères fiables, caractéristiques, généraux, explicites et universels Schéma réactionnel En Excès de réactifs En Défaut de réactifs Signal apparition variation Nature du marqueur pas de marqueur Radio isotope Enzyme Fluorochrome Luminescent Particules autres… Représentation en 3 dimensions

Représentation en 3 dimensions

Visualisation directe de la réaction primaire Méthodes utilisant la précipitation des complexes Ag/Ac En solution Ring test Courbe de précipitation Néphélémétrie et turbidimétrie en milieu semi-solide Oudin, Mancini Ouchterlony

Visualisation directe de la réaction primaire en milieu semi solide avec champ électrique Laurell

Visualisation directe de la réaction primaire Agglutination micro organisme Hématies Particules Méthodes fluorométriques Extinction de fluorescence Augmentation de fluorescence Polarisation de fluorescence

Visualisation indirecte de la liaison anticorps/antigène Les différents marqueurs radioactifs Soufre S35, Phosphore P32, Iode I131, Carbone C14, Tritium H3 Problèmes de manipulation, élimination etc... Agent de couplage : glutaraldéhyde, carbodiimide

Visualisation indirecte de la liaison anticorps/antigène Dosage RIA radio immunologique Yalow et Berson (1965) Très grande sensibilité 10-14 M Dosage de molécules petites tailles

Visualisation indirecte de la liaison anticorps/antigène Les marqueurs fluorescents FITC Fluorescéine iso thiocyanate TRITC Tetramethylrhodamineisothiocyanate PE Phycoerytrhin

Visualisation indirecte de la liaison anticorps/antigène Les marqueurs chemiluminescents Système ECL d’Amersham Augmentation de la sensibilité : 10-12 g, soit 10x plus que les méthodes colorimétriques Minimise les fixations non spécifiques Images « propres » Compatible avec tous les supports

Visualisation indirecte de la liaison anticorps/antigène Les marqueurs enzymatiques Phosphatase alcaline Peroxydase Glucose oxydase b galactosidase Nombreux substrats synthétiques Forte activité spécifique Modification chimique possible

Dosages immuno enzymatiques EIA Dosages en phase homogène les réactifs ne sont pas immobilisés sur une phase solide. Pas d ’étape de séparation Dosages en phase hétérogène Un des réactifs est immobilisé sur une phase solide Étape de séparation de la fraction liée de la fraction libre nécessaire

Dosages en phase homogène Principe Inhibition ou activation de l ’activité de l ’enzyme lors de la fixation de l ’antigène marqué sur le site anticorps Substances conjugués aux antigènes des enzymes !

Dosage en phase homogène (2) haptène substrat anticorps

Courbe de dosage Absorbance [haptène]

Dosage en phase homogène (3) Caractères particuliers de ces méthodes pas d’étape de séparation automatisation facilitée L ’activité enzymatique est susceptible de réagir avec les constituants de l ’échantillon contrôle rigoureux des conditions de mesures (pH, température etc.)

Dosage en phase homogène (4) moins sensible que les tests ELISA Essentiellement pour des mesures de concentrations élevées dosages de composés de faible poids moléculaire (médicaments, pesticides, drogues etc…)

Dosages en phase hétérogène Principe l ’antigène resté libre est toujours séparé du réactif marqué lié, après l ’étape d ’incubation. Dosage de grosses molécules, protéines etc... Problèmes pour l ’automatisation : étape de séparation centrifugation précipitation lavage filtration billes magnétiques

Dosages en phase hétérogène(2) Deux grands principes existent : réactions de compétition réactions « sandwich » Nature du conjugué antigène marqué par l ’enzyme anticorps marqué par l ’enzyme

Principe de compétition Compétition entre l ’antigène à doser et un antigène marqué avec une enzyme, vis-à-vis d ’une quantité fixe d ’anticorps Les trois réactifs sont incubés ensemble Les anticorps fixent moins de molécules d ’antigène quand les concentrations en antigène présent augmentent Étalonnage à partir de standards

Principe de compétition (2)

Principe de compétition (3) S P Anticorps de capture Antigène à doser conjugué substrat

Principe de compétition (4) Absorbance [antigène] Le signal est inversement proportionnel à la concentration en antigène

Dosage de l’antigène Hbs

Dosage de l’antigène Hbs

Principe sandwich Utilisé pour le dosage d ’antigènes multivalents Poids moléculaire élevé de l ’antigène anticorps de capture en excès étapes de séparations nécessaires l ’antigène à doser est pris en sandwich entre les anticorps

Principe sandwich (2) 1ère étape d ’incubation immunologique Anticorps de capture immobilisés Antigènes à doser

Principe sandwich (3) 2ème étape d ’incubation immunologique Conjugué immuno-enzymatique

Principe sandwich (4) S P Produit coloré

Principe sandwich (4) Le signal est proportionnel Absorbance [antigène] Le signal est proportionnel à la concentration en antigène

Récapitulatif

Exemple : test de présence de l’hcg dans les urines http://www.whfreeman.com/kuby/con_index.htm?06

Elispot

Traitement des résultats Gamme de concentration très grande Échelle semi logarithmique Effet crochet pour les fortes concentration en antigène phénomène de compétition

Traitement des résultats (2) Représentation linéaire en fonction de la concentration Représentation semi logarithmique en fonction de la dilution

Traitement des résultats (3) Limite de sensibilité

Immuno PCR Développement des principes de base (1999) Deux schémas existent : PCR-ELISA : l ’ELISA sert à doser les résultats de la PCR Immuno PCR : la PCR sert à quantifier un test ELISA

PCR-ELISA On réalise une PCR, avec des primer marqués à la digoxygénine On obtient des fragments « naturellement » marqués à la digoxygénine. Dénaturation et hybridation avec une sonde marquée au FITC. Capture et dosage par un anticorps Anti-FITC et un anticorps anti-DIG marqué à la POD.

PCR-ELISA : principe Sang Dénaturation Cellules mononuclées Sonde marquée FITC RNA Hybridation Incubation sur µplaque cDNA DIG primer DIG dNTP PCR Produits PCR marqués à DIG Détection avec anti DIG marqué à la POD

PCR-ELISA : avantages Quantification possible d ’un gène Pas d ’utilisation de marqueur radio actifs, fluorescents Méthode semi quantitative pour comparer les répertoires de différents individus.

Immuno PCR La PCR constitue l ’étape de marquage Utilisation du très grand pouvoir d ’amplification de la PCR Utilisation d ’un conjugué biotine-ADN qui va servir de matrice pour la PCR On dose les produits de la PCR, par marquage au BET

Immuno PCR : principe Anticorps biotinylé Avidine Sonde ADN Biotinylée

Immuno PCR : avantages/inconvénients Nécessite de très faibles quantité de matrice Applicable à des antigènes de taille très variable Augmentation de la sensibilité d ’un facteur 5 Détection de l ’ordre de l ‘ attomole Utilisation du BET pur le dosage de la des produits de PCR