TECHNIQUES SPECIALES EN ANATOMIE PATHOLOGIQUE ED n°2, DCEM1 Purpan, 2011-2012

Techniques spéciales Microscopie électronique Histoenzymologie Immunohistochimie Biologie moléculaire Cytométrie en flux Télépathologie

Immunohistochimie Techniques Interprétation Matériel coupes en paraffine ou coupes en congélation Mode de visualisation Immunofluorescence (UV) Immunoenzymatique (peroxydase ou phosphatase alcaline- lumière blanche) Interprétation batterie d’anticorps témoins intrinsèques, réactivité croisée

Immunohistochimie 1 = Antigène 2 = Anticorps primaire 3 = Anticorps secondaire couplé au complexe avidine-biotine péroxydase 4 = Révélation par substrat de la peroxydase

Immunohistochimie Applications pathologie hémolymphatique Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels classification des lymphomes pathologie tumorale identification des tumeurs malignes indifférenciées substance spécifique de certaines tumeurs expression des R hormonaux évaluation de la croissance tumorale recherche cibles thérapeutiques pathologie non tumorale pathologie rénale : glomérulopathies pathologie cutanée bulleuse pathologie inflammatoire (ex: agent pathogène)

Immunohistochimie Applications pathologie hémolymphatique Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels classification des lymphomes pathologie tumorale identification des tumeurs malignes indifférenciées substance spécifique de certaines tumeurs expression des R hormonaux évaluation de la croissance tumorale recherche cibles thérapeutiques pathologie non tumorale pathologie rénale : glomérulopathies pathologie cutanée bulleuse pathologie inflammatoire

Ag HbS

Immunohistochimie Applications pathologie hémolymphatique Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels classification des lymphomes pathologie tumorale identification des tumeurs malignes indifférenciées substance spécifique de certaines tumeurs expression des R hormonaux évaluation de la croissance tumorale recherche cibles thérapeutiques pathologie non tumorale pathologie rénale : glomérulopathies pathologie cutanée bulleuse pathologie inflammatoire

Immunohistochimie Exemple utilisation des anticorps monoclonaux dans le diagnostic des tumeurs malignes sur coupes en paraffine Tumeurs KL1 Anti-LCA (CD45) Anti- PS100 HMB45 Carcinome + - Lymphome Sarcome +/- Mélanome

Immunohistochimie applications

Ganglion médiastinal HE

Ganglion médiastinal HE

Ganglion médiastinal IHC anti-CD45

Ganglion médiastinal IHC KL1

KL1+ Anti-CD45- Métastase ganglionnaire d’un carcinome

Tumeur cutanée indifférenciée

Tumeur cutanée indifférenciée: IHC KL1

Tumeur cutanée indifférenciée:IHC HMB45

Tumeur cutanée indifférenciée: IHC anti-protéine S100

KL1- HBM45+ Anti-PS100+ Mélanome

Immunohistochimie Applications pathologie hémolymphatique Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels classification des lymphomes pathologie tumorale identification des tumeurs malignes indifférenciées substance spécifique de certaines tumeurs expression des R hormonaux évaluation de la croissance tumorale recherche cibles thérapeutiques pathologie non tumorale pathologie rénale : glomérulopathies pathologie cutanée bulleuse pathologie inflammatoire

Ganglion cervical métastatique, HE

Métastase d’un adénocarcinome thyroïdien Ganglion cervical métastatique: IHC anti-thyroglobuline

Immunohistochimie Applications pathologie hémolymphatique Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels classification des lymphomes pathologie tumorale identification des tumeurs malignes indifférenciées substance spécifique de certaines tumeurs expression des R hormonaux évaluation de la croissance tumorale recherche micrométastases pathologie non tumorale pathologie rénale : glomérulopathies pathologie cutanée bulleuse pathologie inflammatoire

Ganglion sentinelle + = Curage ganglionnaire Mélanome et ganglion sentinelle: recherche de micrométastase par immunohistochimie avec HMB45, non décelable sur H&E Ganglion sentinelle + = Curage ganglionnaire

Techniques spéciales Microscopie électronique Histoenzymologie Immunohistochimie Biologie moléculaire hybridation in situ PCR Cytométrie en flux Télépathologie

Biologie moléculaire Hybridation in situ Techniques Applications Coupes en paraffine ou coupes en congélation Sondes froides (= non radio-actives) Chromogéniques (CISH) Fluorescentes (FISH) Applications Détection du génome de certains virus Détection de translocations chromosomiques, d’amplification génique

HPV

Utilité diagnostique: Sarcome de Darier-Ferrand Détection par FISH d’une fusion entre les chromosomes 17 et 22 dans une lésion cutanée Utilité diagnostique: Sarcome de Darier-Ferrand

Utilité thérapeutique Prescription d’un inhibiteur de Erb-2 Détection par FISH d’une amplification du gène HER2 dans un carcinome mammaire DuoCISH™, Dako HER2 / Cen17 Non amplifié Amplifié Utilité thérapeutique Prescription d’un inhibiteur de Erb-2

Biologie moléculaire PCR (Polymerase Chain Reaction) Rappel de son principe Technique Applications

1/ Principe de la PCR 3 étapes: - dénaturation thermique: 94°C, 30s à 1 mn - hybridation des amorces (annealing): 40 à 70°C,1 min - élongation: 72°C, durée variable selon le fragment à amplifier Dénaturation + Hybridation + Elongation = 1 cycle au cours duquel quantité ADN cible x 2. Au bout de n cycles: 2n molécules ADN cible.

2/ Principales étapes de la technique

3/ Applications en anatomie pathologique Anomalies géniques Mutation Translocations chromosomiques Mise en évidence de la clonalité lymphoide

Mutation Ex: mutation du gène BRAF dans le mélanome métastatique Séquençage du produit PCR correspondant à l’amplification de la zone du gène où se situe la mutation Intéret thérapeutique (prescription d’un inhibiteur de BRAF)

Translocation chromosomique Détection par PCR à l’aide de deux amorces encadrant la zone réarrangée CHR 2 CHR 5 Amorce A Amorce B Gène A Gène B Intérêt diagnostique (translocation spécifique de tumeur) Intérêt pronostique (ex: recherche de la maladie résiduelle après traitement d’un lymphome porteur de cette translocation)

Prolifération polyclonale bénigne Prolifération monoclonale maligne Polyclonalité et monoclonalité lymphoide Prolifération polyclonale bénigne Prolifération monoclonale maligne Comment établir le caractère clonal ou polyclonal ? Identité ou non-identité du récepteur à l’Ag qui caractérise un lymphocyte donné Ig pour lymphocyte B TCR pour lymphocyte T Intérêt diagnostique

Etablissement de clonalité par PCR V D J Monoclonal Etablissement de clonalité par PCR V D J Polyclonal

Contraintes a- ADN de bonne qualité * délai de congélation * qualité et temps de fixation (Formol) b- Contaminations - lors des coupes (changer de lames, de gants entre chaque cas, nettoyer le support de lames) - lors de toutes les phases d’extraction d’ADN, d’amplification et d’électrophorèse. c- Contrôles : Témoin négatif (eau) Témoin positif

Les immunoglobulines (Ig): récepteurs à l’antigène des lymphocytes B Partie variable des Ig: carte d’identité d’un lymphocyte B

La diversité combinatoire

La diversité jonctionnelle 2/ Addition aléatoire de nucléotides (TdT) 1/ Délétion de nucléotides en aval de V, en amont de J ou de part et d’autre de D 2/ Addition aléatoire de nucléotides (TdT) V N J C2 Zone jonctionnelle D

PCR 1- BREF RAPPEL double hélice ADN A T T G C T A A C G A T T G C 2 brins antiparallèles enchaînement de bases reliées entre elles par des liaisons hydrogènes faibles et thermolabiles : A T T G C T A A C G A T T G C T A A C G A T T G C T A A C G dénaturation thermique molécule double brin 2 molécules simple brin

Applications Maladies infectieuses : Virus (HPV : non cultivable,CMV: rejet de greffe rénale, VIH...), bactéries (à croissance lente : mycobactéries)… Anomalies géniques - Mutation - Translocation chromosomique détection de la t(14;18) par PCR: amplification de la zone jonctionnelle, variable d’un clone à l’autre. t(2 ;5) et lymphomes anaplasiques à grandes cellules - Etablissement de la clonalité lymphoïde CHR 2 CHR 5 amorce