UNIVERSITE DE PICARDIE JULES VERNE Faculté de Pharmacie Chimie Organique- EA3901-DMAG-INERIS CHIMIE COMBINATOIRE A. Dassonville, P. Sonnet Mai 2005

CONTEXTE Recherche d’un médicament complexe, long et coûteux Temps estimé entre la première synthèse et la mise sur le marché : 10-15 ans Nécessité de préparer et d’évaluer plusieurs centaines d’analogues Coût estimé : 300-800 millions de dollars par médicaments Objectifs des entreprises : 1 à 3 nouveaux médicaments par an Progrès de la génomique : découverte d’un grand nombre de cibles nouvelles pour les médicaments développement et mise au point de méthodes automatisées pour une détermination rapide de l’activité sur de nombreux composés différents (criblage haut débit sur plusieurs milliers de produits par semaine vis à vis d’une ou plusieurs cibles biologiques simultanément). L’extraction de substances naturelles et la synthèse organique ne produisent pas assez de produits SOLUTION Création rapide de bibliothèques de composés célibataires ou de mélanges par les techniques de synthèses parallèles ou combinatoires

synthèse sur support solide initiée par Merrifield. HISTORIQUE Naissance dans les années 80 par un besoin des spécialistes de la science du peptide, inspirés par la synthèse sur support solide initiée par Merrifield. 1984 Geyson met en place une technique « multi-pin » et produit de nombreux peptides. 1985 Houghton met en place la méthode des « tea bags » qui consiste à mettre en suspension des sacs poreux de résine dans les réactifs. 1992 Bunin et Ellman publie la première bibliothèque de petites molécules actives par voie orale et préparées sur support solide : les 1,4-benzodiazépin-2-ones. Chimie combinatoire en solution utilisant des polymères solubles Thompson et Ellman font un point sur la Chimie Combinatoire Naissance de 3 journaux spécialisés : Journal of Combinatorial Chemistry, Molecular Diversity et Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. Développement de petites entreprises spécialisées dans le Criblage Haut Débit 2002 Recensement de plus de 1000 bibliothèques De nos jours, toutes les grandes firmes pharmaceutiques utilisent la Chimie Combinatoire.  

1995 : Développement de petites entreprises spécialisées dans le Criblage Haut Débit La plupart des exemples de synthèses combinatoires ont été publiées par des scientifiques de ces petites entreprises. Ces entreprises après avoir commencées par la synthèse de bibliothèques de peptides, sont impliquées dans le développement de bibliothèques de petites molécules. La plupart sont impliquées dans le développement de nouveaux synthétiseurs.

LOCALISATION DE LA CHIMIE COMBINATOIRE DANS LA DECOUVERTE D’UN CANDIDAT MEDICAMENT

Synthèse organique conventionnelle : Synthèse organique combinatoire : COMPARAISON DE LA CHIMIE ORGANIQUE CONVENTIONNELLE ET DE LA CC Synthèse organique conventionnelle : Synthèse organique combinatoire : . Réaction de n composés A avec n’ composés B conduit à un mélange de nn’ composés différents. Aucune séparation n’est effectuée à ce stade. Le mélange est testé. Si le résultat est positif, identification du composé responsable de l’activité.

SYNTHESE COMBINATOIRE MULTIETAPE Nb = 5m Contraintes au niveau de la synthèse chimique employée, chaque produit doit être obtenu avec un bon rendement et pas de sous produits formés. L’ensemble des produits possibles préparés = bibliothèque. Selon la méthode utilisée, une bibliothèque est constituée de produits différents isolés (synthèse parallèle) ou d’un mélange de composition définie (synthèse combinatoire).

1. Unités réactives bifonctionnelles STRATEGIES 1. Unités réactives bifonctionnelles Les réactions sont successives, chaque unité réagit avec une des fonctions de la suivante. 2. Composés multifonctionnels Les synthons B, C et D réagissent avec un dérivé central A présentant plusieurs fonctions différentes. 3. Modulation de la fonctionnalité Après réaction avec B, la réactivité de A est modifiée. La réaction avec C donne un produit ABC.

CHOIX DU MILIEU REACTIONNEL En général, les réactions sont effectuées en phase solide mais de nouvelles stratégies comme la chimie combinatoire sur polymère soluble émergent.

METHODE PARTAGE/MELANGE Taille de la bibliothèque? SYNTHESE DE MELANGE, METHODE PARTAGE/MELANGE Dans quel cas? Identification d’une tête de série Taille de la bibliothèque? Jusqu’à 10000 composés mélangés Cette méthode a été mise au point pour éviter les problèmes de différences de réactivité et/ou de cinétique. Préalablement à chaque étape de la synthèse combinatoire, le polymère est divisé en un nombre de lots égal au nombre de réactifs introduits au cours de cette étape. Chaque réactif est alors mis en réaction en excès individuellement dans chaque réacteur séparé. Ici 27 produits sous la forme de 3 mélanges constitués de 9 composés chacune. 9 réactions ont été nécessaires alors qu’une méthode synthétique classique aurait nécessité 81 réactions.

SYNTHESE DE COMPOSES CELIBATAIRES, SYNTHESE EN PARALLELE Dans quel cas? Optimisation de la structure de la tête de série Taille de la bibliothèque? Jusqu’à 1000 composés

PROCEDES UTILISES POUR LA SYNTHESE PEPTIDIQUE Procédé Houghton, dit des « sachets de thé » Permet de synthétiser 150 peptides en une seule opération : 1er AA ajouté à la résine en plaçant le sachet dans une bouteille (chaque bouteille recevant un AA différent). dans chaque bouteille, tous les sachets ont un même type d’AA fixé à la résine. bouteille après bouteille, les sachets sont rassemblés dans un récipient unique afin de procéder à la déprotection et au rinçage. les sachets sont ensuite repositionnés dans une autre bouteille contenant un autre AA et ainsi de suite….   Automatisation des synthèses en parallèle Le support , phase solide se présente sous forme de bâtonnets (picots) qui peuvent être plongés dans chaque puit ayant un AA bien précis. Pour la déprotection et le rinçage, trempage des bâtonnets dans de vastes bains.

Synthèse des réactions organiques appliquées sur support solide CREATION DE BIBLIOTHEQUES DE PETITES MOLECULES Synthèse des réactions organiques appliquées sur support solide

Bibliothèques synthétisées

Exemple 1 : Bibliothèque de Pipérazines sur support solide

Exemple 2 : Bibliothèque de dicétopipérazines sur support solide

Exemple 3 : Bibliothèque de sulfamides sur support soluble

Exemple 4 : Bibliothèque de macrocycles mimant un coude  sur support solide

IDENTIFICATION DES SUBSTANCES ACTIVES Répartition orthogonale : -Technique utilisable dans le cas d’une réaction à une étape Deux répartitions différentes de composés de la même bibliothèque Série de sous bibliothèque où A est fixe et une où B est fixe Toutes les sous bibliothèques sont testées, si le résultat est positif alors 2 sous bibliothèques montreront une activité Connaissant l’unité fixée dans l’une et l’autre des deux sous séries, il est possible de remonter à la substance active.

Positional scanning : - Même principe de répartition en sous bibliothèques - Adaptation aux synthèses multiétapes Pour chaque position, on prépare autant de sous bibliothèques qu’il y a de composants dans cette position Avantage : ne nécessite pas de synthèse supplémentaire si un composé se révèle actif

Déconvolution récursive dans le cas de la méthode partage/mélange : Après chaque étape de partage, une partie des produits est stockée. Ces substances stockées seront utilisées au moment de la resynthèse. Dans l’exemple ci dessus, à chaque étape, une brique est identifiée.

Par utilisation de code chimique : greffage de l’unité synthétique et de son code sur la résine Mélange puis partage, seconde unité attachée à la première, son code est greffé sur le support de manière non séquentielle Molécule supportée est évaluée par l’intermédiaire d’un test coloré Résine portant la molécule active est isolée puis décodée (le code peut être déchiffré sous forme binaire) Tag :

Photolithographie : Ce qu’il faut : un procédé de synthèse permettant d’obtenir des produits avec une répartition spatiale définie. Dans le cas d’une synthèse peptidique, les groupements amines portent un groupement photolabile, déprotection à un endroit bien précis, couplage, lavage et répétition avec un cache différent. Incubation de la plaque en présence d’un récepteur protéique, marqué par une substance susceptible de fluorescer, en vu de détecter les composés actifs. On retrouve les composés actifs car les caches sont numérotés au fur et à mesure. L’intensité de la fluorescence peut être mesurée à l’aide d’un microscope spécial afin de déterminer le degré d’affinité. Alternatives : méthodes radioactives et chimiluminescence.

Criblage « sur bille » : Une « bille » positive dans un test colorimétrique de liaison avec une enzyme. Un échantillon de « billes » positives à des intensités variables. Les composés actifs accrochés aux résines sont ensuite récupérés par micromanipulation.

EXEMPLE D’UNE ETUDE Objectif : Trouver un inhibiteur d’une méthyltransférase (famille de Erm), enzyme responsable d’une résistance vis à vis d’antibiotiques en interférant avec leur site de liaison. Après un screening utilisant la RMN (RSA par RMN), une triazine interférant avec le site d’action de l’enzyme est isolée. Les analogues A, B et C de la même bibliothèque ont été identifiés.

Une étude par intermédiaire d’une synthèse en parallèle en solution a permis la découverte de D comme analogue le plus actif. Une bibliothèque de 232 composés a ensuite été préparée pour trouver le substituant de gauche qui induisait la plus grande affinité, E et F sont de l’ordre du micromolaire. Une bibliothèque de 411 composés a ensuite été préparée pour trouver le substituant de droite qui induisait la plus grande affinité.