LE DICHROISME CIRCULAIRE Application aux protéines UNIVERSITE DE PICARDIE JULES VERNE Faculté de Pharmacie Chimie Organique - EA3901-DMAG J. Pêcher, P. Sonnet, F.Y. Dupradeau LE DICHROISME CIRCULAIRE Application aux protéines 22 décembre 2006

Le dichroïsme circulaire est utilisé pour étudier la structure des : Protéines Sucres ADN Molécules chirales telles que cofacteur (pyridoxal-5’-phosphate), des flavines,des tri terpènes (acide ursolique), les hèmes,les flavocytochrome, des pigments photosynthètiques etc …

- Détermination du contenu en structure secondaire de protéines Deux régions spectrales intéressantes pour obtenir des informations structurales : UV lointain 180 nm à 250 nm : - Effet de l’environnement sur la structure d’une molécule - Détermination du contenu en structure secondaire de protéines - Effet de ligands sur la structure - Etudes d’interactions protéine-protéine et acides nucléiques-protéines - Etudes dynamiques (dénaturation, renaturation) 2) UV proche 250 nm à 350 nm : - Empreinte digitale de la structure tertiaire - Effet de ligands sur la structure - Effet de l’environnement sur la structure d’une molécule

3) Conditions opératoire : Détermination de la concentration exacte de la molécule à étudier : méthode colorimétrique (biuret, Folin-lowry, Bradford …) A280nm lecture directe (avantage non destructif) Calibration du dichographe suivant la région spectrale étudiée Choix de la cuve (trajet optique) : 10 mm, 1 mm, 0.1 mm, 0.5 mm, 0.001 mm Choix de la région spectrale (UV lointain ou UV proche) Faible concentration µmol.L-1

1) UV lointain 180 nm à 250 nm : chromophore liaison peptidique n ->π* électrons de non liaison de l’N du C du carbonyle π->π* électrons π du carbonyle L’intensité et l’énergie de transition dépendent des angles Φ et ψ  des structures secondaires Hélice α Feuillet β Coude β Hélice polyproline II Structure aléatoire spectres caractéristiques des différentes structures secondaires

bande positive à 192 nm transition π->π* Hélice α bande positive à 192 nm transition π->π* bande négative à 209 nm transition π->π* - bande négative à 222 nm transition n->π* 209 nm 222 nm Feuillet β - bande positive à 196 nm transition n->π* - bande négative à 218 nm transition π->π* 196 nm 218 nm

bande négative à 190 nm transition n->π* Coude β bande négative à 190 nm transition n->π* - bande positive à 210 nm transition π->π* 210 nm 190 nm Aléatoire bande négative à 195 nm transition n->π* 195 nm 220 nm Hélice polyproline II - bande négative à 192 nm transition n->π - bande positive à 220 nm transition π->π* 192 nm

2) UV proche 250 nm à 350 nm : chromophore chaîne latérale des acides aminés aromatiques et pont disulfure Phénylalanine Tyrosine Maximum d’absorbance à 276 nm et un épaulement à 283 nm Maximum d’absorbance à 254, 256, 262 et 267 nm Spectre de la II dehydroquinase et de son mutant R23Q Tryptophane Cystine Large bande entre 250 et 300 nm bande intense centrée sur 282 nm

Détermination du contenu en structure secondaire de protéine Exemple de la myoglobine, de la triosephosphate isomérase, du lysozyme et de la chymotrypsine Deconvolution et obtention du pourcentage de structures secondaires myoglobine triosephosphate isomerase Structure en % Hélice α Feuillet β Coude β Aléatoire myoglobine 75 10 12 Triosephosphate isomérase 52 14 11 23 lysozyme 36 9 32 chymotrypsine 34 20 lysozyme chymotrypsine Spectre DC de différentes protéines

Effet de l’environnement sur la structure d’une molécule l’UV proche et l’UV lointain - Cosolvant : TFE SLEEEWAQVECEVYGRGCPSGSLDESFYDWFERQLG S TRP Point isodichroïc à 203 nm  transition entre deux états Observation de l’UV proche

Effet de l’environnement sur la structure d’une molécule l’UV proche et l’UV lointain - Cosolvant : TFE Spectre de DC de la chaîne A de l’insuline en présence de quantité croissante de TFE A partir de 30 % de TFE, stabilisation d’une structure de type Hélice α

Effet de l’environnement sur la structure d’une molécule l’UV proche et l’UV lointain - pH Spectre DC de l’α-lactalbumine. (a) et (b) représentent les spectres DC de l’UV lointain et de l’UV proche. Spectre à pH 7 en trait plein et spectre pH 2 en trait pointillé. S.M Kelly et al., BBA, 2005, 1751, 119-139

Effet de ligands sur la structure en UV lointain et en UV proche Spectre de DC de la protéine ModE de E.coli dans l’uv proche en présence et en absence de ligand (1 mM molybdate) Spectre de DC de la protéine ModE de E.coli dans l’uv lointain en présence et en absence de ligand (1 mM molybdate) La fixation d’un ligand n’a pas forcément d’impact sur les structures secondaires mais peut provoquer des changements dans la structure tertiaire. S.M Kelly et al., BBA, 2005, 1751, 119-139

Spectre DC de la chaîne B de l’ insuline Etude dynamique en présence de dénaturant tel que urée et GuHCl Spectre DC de la chaîne B de l’ insuline A) des quantités croissantes de GuHCl 0,1-1.0 M et b) evolution de l’ellipticité a 220 nm en fonction de la quantité de GuHCl D.P Hong et al., Biochemistry, 2006, 45, 9342-9353

Etude dynamique en fonction de la température GPP3 GPP5 Détermination du Tm Détermination de l’enthalpie ΔH Détermination de l’entropie ΔS B

Graphique de Van’t Hoff GPP3 : GPP5 Ln K = ΔH/RT- ΔH/(RTm) GPP5 : GPP3 Ln K = ΔH/RT- ΔH/(RTm) + Ln (0,75 C2) ΔG = nRTlnK ΔG = ΔH -TΔS A Tm, on a K=1 ΔG=0 et ΔS= ΔH/Tm GPP3  Tm K=1 : ΔHvH = -44,8kJ/mol et ΔSvH = -144,3 J/mol.K GPP5  Tm K=1 : ΔHvH = -87,6kJ/mol et ΔSvH = -279,7 J/mol.K

Etude structurale Peptide pro ou anti-thrombotique Trimère proline Trimère hydroxyproline Trimère GPP3 GPP5 Gly-Pro-Cys –(Gly-Pro-Pro)5-Lys-Hyp-Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Lys-(Gly-Pro-Pro)5-Gly-Pro-Cys GPP5 scramble Gly-Pro-Cys –(Gly-Pro-Pro)5-Hyp-Hyp-Lys-Lys-Glu-Pro-Gly-Gly-(Gly-Pro-Pro)5-Gly-Pro-Cys (Gly-Pro-Pro)10 GPP10 Caractérisation de la super structure en triple hélice Détermination des constantes thermodynamiques : Tm, ΔH, ΔS

Dichroïsme circulaire DSC HPLC Polarimétrie Dichroïsme circulaire DSC B

Réaliser des dynamiques moléculaires de ces différents composés But : observer de manière dynamique la stabilisation de la triple hélice de collagène Gly-Pro-Cys –(Gly-Pro-Pro)5-Lys-Hyp-Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Lys-(Gly-Pro-Pro)5-Gly-Pro-Cys