Principes biochimiques de base Notions d’enzymologie Chapitre 5 Principes biochimiques de base titre 3ème partie Notions d’enzymologie

plan 1. Mécanisme de catalyse. 1.1. Fonctionnement des enzymes. 1.1.1. Propriété des catalyseurs. 1.1.2. Créer un environnement favorable. 1.2. Relation enzyme / substrat. 2. Les paramètres enzymatiques. 2.1. Les facteurs influençant la vitesse. 2.1.1. Reconnaissance du Substrat. 2.1.2. Vitesse de catalyse. 2.1.3. Concentration en substrat. 2.2. Détermination des paramètres. 2.2.1. Cinétique enzymatique. 2.2.2. Représentation de Michaelis. 2.2.3. Méthodes de détermination des paramètres. 2.2.4. Les unités. 3. Les iso-enzymes.

Les enzymes sont des catalyseurs biologiques. 1. Mécanisme de catalyse. Les catalyseurs sont des molécules qui accélèrent la vitesse d’une réaction. 1.1. Fonctionnement des enzymes. 1.1.1 1.1.1. Propriété des catalyseurs. Ils possèdent des propriétés caractéristiques. Ils ne subissent pas la réaction. (Ils n’apparaissent pas dans l’équation globale). Ils ne modifient pas l’équilibre de la réaction. Ils ne modifient pas l’énergie de la réaction. Les enzymes sont des catalyseurs biologiques. Ce sont des protéines. Cependant, on a mis en évidence chez certains ARN des propriétés catalytique. Ils sont des milliers de fois plus efficaces que les catalyseurs chimiques. PLAN 3

1.1.1 1. Mécanisme de catalyse. 1.1. Fonctionnement des enzymes. Les catalyseurs sont des molécules qui accélèrent la vitesse d’une réaction. 1.1. Fonctionnement des enzymes. 1.1.1 1.1.1. Propriété des catalyseurs. Temps nécessaire à la transformation de la moitié des réactifs. Nombre de réactions par seconde. enzyme T1/2 non enzymatique Nombre de cycles Augmentation de la vitesse Décarboxylase d’OMP 78 000 000 ans 39 1,4.1017 Phosphodiestérase 2,9 ans 2 100 2,7.1011 enzyme T1/2 non enzymatique Nombre de cycles Augmentation de la vitesse enzyme T1/2 non enzymatique Nombre de cycles Augmentation de la vitesse Décarboxylase d’OMP 78 000 000 ans 39 1,4.1017 Phosphodiestérase 2,9 ans 2 100 2,7.1011 Anhydrase carbonique 5 s 1.106 7,7.106 enzyme T1/2 non enzymatique Nombre de cycles Augmentation de la vitesse Décarboxylase d’OMP 78 000 000 ans 39 1,4.1017 Voir le cours de première !  enzyme intervient dans la biosynthèse des pyrimidines Dégrade AMPc par exemple Réaction dans le GR CO2 + H2O ---> HCO3- + H+ PLAN 4

Exemple: aldolisation Dihydroxyacétone phosphate 1. Mécanisme de catalyse. 1.1. Fonctionnement des enzymes. Exemple: aldolisation 1.1.1 1.1.1. Propriété des catalyseurs. L’enzyme catalyse la réaction dans les deux sens. CH2PO4 O OH CH2PO4 O OH La conformation des produits est analogue à celle du substrat seul. CH2PO4 C O CH2OH CHO CHOH CH2PO4 Dihydroxyacétone phosphate DHP Glycéraldéhyde 3 phosphate G3P PLAN 5

1.1.2 1. Mécanisme de catalyse. 1.1. Fonctionnement des enzymes. H2O 1.1. Fonctionnement des enzymes. 1.1.2 1.1.2. Créer un environnement favorable. La forme compacte interdit l’intrusion de molécules parasites (eau). La forme permet l’orientation optimale des réactifs. PLAN 6

Les deux structures doivent être les plus complémentaires possibles. 1. Mécanisme de catalyse. La reconnaissance est la première étape de l’activité enzymatique. Il s’agit de la fixation du substrat sur le site spécifique de l’enzyme. 1.2. Relation enzyme / substrat. 1.2 Les deux structures doivent être les plus complémentaires possibles. Complémentarité … de forme … de charge enzyme + - - + + + - - WINNER Looser! PLAN 7

1.2 1. Mécanisme de catalyse. 1.2. Relation enzyme / substrat. Glu 270 La bonne conformation du site permet la fixation du substrat. AA non collaborateurs ne jouent aucun rôle connu sur la conformation du site. Carboxypeptidase A 3 classes d’acides aminés participent à la conformation du site de reconnaissance. Site de reconnaissance Glu 270 AA de contacts créent les liaisons avec le substrat La protéine change de conformation pour permettre la catalyse. AA auxiliaires positionnent les AA de contact et forment la structure du site. Tyr 248 AA collaborateurs AA de la protéines ne faisant pas parti du site mais dont la position influe sur celles des auxiliaires. La carboxypeptidase A reconnaît le résidu C terminal d’une protéine possédant un noyau aromatique (ou une chaîne volumineuse) Arg 145 PLAN 8

Modèle d’adaptation induite 1. Mécanisme de catalyse. 1.2. Relation enzyme / substrat. La fixation du substrat s’accompagne d’un changement de conformation du site qui permet la bonne orientation des groupes catalytique du site actif. Hexokinase glucose Site catalytique Modèle d’adaptation induite (Koshland) 1.2 12/11/2014 On dirait la sonde Philae larguée par Rosetta sur la comète… Changement de conformation PLAN 9

Mauvaise reconnaissance. 2. Les paramètres enzymatiques. La reconnaissance du substrat intervient dans la vitesse de la réaction. 2.1. Les facteurs influençant la vitesse. 2.1.1. Reconnaissance du Substrat. 2.1.1 Enzyme Substrat Bonne reconnaissance. Mauvaise reconnaissance. Y’a les bonnes enzymes et y’a les mauvaises enzymes… PLAN 10

La vitesse de catalyse intervient dans la vitesse de la réaction. 2. Les paramètres enzymatiques. La vitesse de catalyse intervient dans la vitesse de la réaction. 2.1. Les facteurs influençant la vitesse. 2.1.2. Vitesse de catalyse. 2.1.2 Enzyme Substrat Bonne catalyse. Mauvaise catalyse. Tu vois, la bonne enzymes, elle voit le substrat… PLAN 11

La concentration intervient dans la vitesse de la réaction. 2. Les paramètres enzymatiques. La concentration intervient dans la vitesse de la réaction. 2.1. Les facteurs influençant la vitesse. 2.1.3. Concentration en substrat. 2.1.3 Enzyme Substrat Bonne catalyse. Mauvaise catalyse. Super important la concentration… PLAN 12

2.2.1 + exo1 2. Les paramètres enzymatiques. 2.2. Détermination des paramètres. 2.2.1 + exo1 2.2.1. Cinétique enzymatique. Exercice d’exploration 1 PLAN 13

2.2.2 + exo2 2. Les paramètres enzymatiques. 2.2. Détermination des paramètres. 2.2.2 + exo2 2.2.2. Représentation de Michaelis. Les enzymologistes caractérisent l’efficacité d’une enzyme en fonction de l’effet de la concentration en substrat. C’est pourquoi, l’étude enzymatique débute par la mesure des vitesses initiales des réactions à différentes concentrations. Exercice d’exploration 2 PLAN 14

2.2.2 2. Les paramètres enzymatiques. 2.2. Détermination des paramètres. 2.2.2 2.2.2. Représentation de Michaelis. Leonor Michaelis (Berlin, 16 janvier 1875 - New York, 8 octobre 1949) est un biochimiste et médecin allemand, renommé pour son travail avec Maud Menten sur la cinétique enzymatique et l'équation de Michaelis-Menten, proposée en 1913. Wikipédia PLAN 15

2.2.2 2. Les paramètres enzymatiques. 2.2. Détermination des paramètres. Commenter l’allure du graphe. 2.2.2 2.2.2. Représentation de Michaelis. La vitesse de la réaction augmente avec la concentration en substrat. …jusqu’à atteindre un palier. Vi en µmol.L-1.mn-1 Si C = infinie, la vitesse est maximale. La pente diminue progressivement… Si C = 0, la vitesse est nulle. C’est logique ! PLAN 16

2.2.2 2. Les paramètres enzymatiques. Le calcul des paramètres 2.2. Détermination des paramètres. 2.2.2 2.2.2. Représentation de Michaelis. Vi = valeur de l’asymptote Plus Vi est grand, plus l’enzyme est efficace. Vi en µmol.L-1.mn-1 Vi Vi/2 Si C = infinie, la vitesse est maximale. Premier paramètre = Vi Km deuxième paramètre = Km PLAN 17

2.2.2 2. Les paramètres enzymatiques. Le calcul des paramètres 2.2. Détermination des paramètres. 2.2.2 2.2.2. Représentation de Michaelis. Cette représentation présente un gros défaut. Vi en µmol.L-1.mn-1 Vi Exercice d’exploration 3 A cause de la nature du palier, les valeurs de Vi sont souvent très imprécises. Vi/2 Soit on utilise un logiciel spéciale pour traiter les valeurs de la courbe. Soit on change de représentation. Km PLAN 18

2.2.3 2. Les paramètres enzymatiques. Le calcul des paramètres 2.2. Détermination des paramètres. 2.2.3 2.2.3. Méthodes de détermination des paramètres. Méthode graphique Méthode informatique Vi en µmol.L-1.mn-1 On utilise l’équation de la droite. Ci = infini ---> 1/Ci = 0 Vm = 1 / 0,066 = 15 µmol.L-1mn-1 2/ Vi Vm = 1/b Km = 0,083 / 0,066 = 1,25 mmol.L-1 Km = a/b 1/ Vi Mais ça, c’est quand vous serez plus grands ! Vm = 1 / 0,066 = 15 µmol.L-1mn-1 1/Km Km = 1 / 0,83 = 1,25 mmol.L-1 PLAN 19

2.2.4 2. Les paramètres enzymatiques. 2.2. Détermination des paramètres. 2.2.4 2.2.4. Les unités. Vm caractéristique de potentiel catalytique de l'enzyme: plus Vm est grand, plus l'enzyme est efficace. vitesse de catalyse (kcat): nombre de molécules de substrat transformées par seconde. Unité enzymatique (UE): µmoles de molécules de substrat transformées par minute. Il existe des unités dérivées. Unité enzymatique par volume de solution (UE.ml-1): UE / volume de solution Activité spécifique (UE.mg-1): UE / masse de protéine PLAN 20

3 3. Les iso-enzymes. PLAN 21 M4 M3H M2H2 MH3 H4 Ce sont des enzymes de structures différentes qui catalysent la même réaction. PLAN 21 3 Lactate déshydrogénase LDH Pyruvate Lactate La LDH est un tétramère de sous unités de 35 kD. Il existe deux types de chaînes appelées M et H qui peuvent former cinq types de tétramères. M4 M3H M2H2 MH3 H4

Lactate déshydrogénase 3. Les iso-enzymes. PLAN 22 Si elles sont différentes, c’est qu’elles ne sont pas pareilles ! 3 Km µmol.L-1 H4 300 MH3 220 M2H2 155 M3H 90 M4 30 Pyruvate Lactate Lactate déshydrogénase LDH WINNER M2H2 M4 M3H MH3 H4 k mol.s-1 1000