45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 27-29 mai 2015, Versailles Identification des gènes et enzymes impliqués dans la dégradation de l’herbicide mésotrione chez Bacillus megaterium Mes11 Carles Louis (1), Besse-Hoggan Pascale (2), Joly Muriel (1), Batisson Isabelle (1)   CNRS UMR 6023, Laboratoire Microorganismes : Génome et Environnement 24, av. des Landais 63171 Aubière louis.carles@univ-bpclermont.fr (2) CNRS UMR 6296, Institut de Chimie de Clermont-Ferrand

La mésotrione Famille chimique Utilisation Mode d’action β-tricétones 2-[4-(methylsulfonyl)-2-nitrobenzoyl]- cyclohexane 1,3-dione Famille chimique β-tricétones Depuis 2003, notamment sur les cultures de maïs Post-levée des adventices (Dicotylédones et Graminées) 150 g.ha-1 Utilisation Foliaire - Systémique Inhibition de la 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) biosynthèse des caroténoïdes Mode d’action 45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 28 mai 2015, Versailles

La mésotrione : devenir dans l’environnement Forte solubilité dans l’eau (160 mg.L-1) Kd faible, d’autant plus que le pH est élevé (forme ionisée) Mobilité et biodisponibilité élevées Caractéristiques physico-chimiques Mésotrione : toxicité sur microorganismes édaphiques Métabolites classiquement retrouvés dans les sols (AMBA et MNBA) Toxicité > ou < mésotrione (Vibrio fisheri, Tetrahymena pyriformis) Ecotoxicité Faible photodégradation Faible hydrolyse Transformations abiotiques Différentes souches : Bacillus sp. Pantoea sp. E. coli Bradyrhizobium sp. Transformations biotiques (Alferness and Wiebe., 2002 ; Bonnet et al., 2008 ; Crouzet et al., 2010, 2013 ; Joly et al., 2012 ; Batisson et al., 2009) (Durand et al., 2006 ; Batisson et al., 2009 ; Pileggi et al., 2012 ; Olchanheski et al., 2014 ; Romdhane et al., 2015) 45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 28 mai 2015, Versailles

Voies de biotransformation de la mésotrione Bacillus megaterium Mes11 Mesotrione hydroxylamino intermediate isoxazolol intermediate Objectif : identifier le(s) enzyme(s) impliquée(s) dans la première étape MNBA Hypothèse : Nitroréductase (NR) AMBA (Batisson et al., 2009) 45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 28 mai 2015, Versailles

9 gènes chez B. megaterium Mes11 Matériel et méthodes Bacillus megaterium Recherche de séquences de gènes de nitroreductases UniProtKB 9 Nitroréductases (B. megaterium QMB1551, WSH002 et DSM319) Alignements, dessin d’amorces Clustal Ω 9 couples d’amorces 9 gènes chez B. megaterium Mes11 9 séquences (A, B, C, C1, D, E, F, G, H) : entre 11 et 64 % similarité (aa) Clonage Séquençage pEXP5CT/TOPO®  poly-His en C-term 45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 28 mai 2015, Versailles

Expression des 9 nitroréductases de B. megaterium Mes11 Matériel et méthodes Expression des 9 nitroréductases de B. megaterium Mes11 E. coli BL21 StarTM (DE3) pLysS Purification Caractérisation Activité nitroréductase Mésotrione et/ou MNBA ? 45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 28 mai 2015, Versailles

Type I (oxygen-insensitive) Nitro FMN reductase 5 sous-familles B. cereus NAD(P)H nitroreductase gi|445995472 B. thuringiensis NAD(P)H nitroreductase gi|766603786 B. simplex NAD(P)H nitroreductase gi|736217234 P. alvei nitroreductase gi|544840327 B. megaterium Mes11 nitroreductase H E. marinum NAD(P)H nitroreductase gi|652429544 B. pumilus NAD(P)H nitroreductase gi|500860819 B. amyloliquefaciens NAD(P)H nitroreductase gi|505200324 B. subtilis NAD(P)H nitroreductase gi|518543240 B. flexus NAD(P)H nitroreductase gi|647637223 B. megaterium Mes11 nitroreductase C P. massiliensis NAD(P)H nitroreductase gi|517715091 L. monocytogenes NAD(P)H nitroreductase gi|502717102 E. faecalis nitroreductase gi|514901944 L. garvieae NAD(P)H nitroreductase gi|518124126 S. thermophilus NAD(P)H nitroreductase gi|754217565 S. xylosus NAD(P)H nitroreductase gi|655525048 B. brevis NAD(P)H nitroreductase gi|515818379 P. durus NAD(P)H nitroreductase gi|647244268 B. megaterium Mes11 nitroreductase D B. cereus NAD(P)H nitroreductase gi|507061038 A. flavithermus NAD(P)H nitroreductase gi|692184367 G. caldoxylosilyticus NAD(P)H nitroreductase gi|516003997 Synechocystis sp. protein DrgA gi|2499211 E. cloacae retro-nitroreductase RNR gi|12232330 E. coli NAD(P)H nitroreductase NfsB gi|446273632 P. putida dihydropteridine reductase PnrB gi|499255844 V. fischeri NAD(P)H flavin oxidoreductase FRase1 gi|6016045 H. influenzae NAD(P)H nitroreductase gi|757820336 P. multocida NAD(P)H nitroreductase gi|492114519 Clostridium sp. NAD(P)H nitroreductase YfkO gi|697197058 S. epidermidis NAD(P)H nitroreductase gi|488415055 B. cereus NAD(P)H nitroreductase YfkO gi|727247411 B. thuringiensis NAD(P)H nitroreductase gi|446107880 B. weihenstephanensis NAD(P)H nitroreductase gi|501216879 B. amyloliquefaciens NAD(P)H nitroreductase YfkO gi|761803365 B. subtilis NAD(P)H nitroreductase gi|768927659 P. polymyxa NAD(P)H nitroreductase gi|647278362 B. pumilus NAD(P)H nitroreductase gi|640668896 B. flexus NAD(P)H nitroreductase YfkO gi|647314326 B. megaterium Mes11 nitroreductase E E. coli protein YdjA gi|331049267 S. enterica oxidoreductase YdjA gi|446261456 B. megaterium Mes11 nitroreductase C1 B. simplex nitroreductase gi|701525716 L. sphaericus cobalamin biosynthesis protein CbiY gi|738162949 B. coagulans nitroreductase gi|651962515 B. megaterium Mes11 nitroreductase A B. simplex nitroreductase gi|701523941 P. alginolyticus nitroreductase gi|656249747 A. baumannii nitroreductase gi|746187851 E. faecium nitroreductase gi|514544400 P. aeruginosa nitroreductase gi|730381179 P. agglomerans nitroreductase gi|666369906 P. graminis nitroreductase gi|647258417 C. beijerinckii nitroreductase gi|515776149 B. simplex nitroreductase gi|736216170 B. cereus nitroreductase gi|759596821 B. thuringiensis nitroreductase gi|446952688 B. flexus nitroreductase gi|647313174 B. megaterium Mes11 nitroreductase G B. amyloliquefaciens FMN reductase gi|515988686 B. subtilis oxidoreductase YcnD gi|82407579 B. flexus FMN reductase gi|647313107 B. megaterium Mes11 nitroreductase NfrA2 P. putida nitroreductase PnrA gi|499255885 B. weihenstephanensis NADPH oxidoreductase gi|666942645 B. amyloliquefaciens NADPH oxidoreductase gi|696300218 B. subtilis NADPH nitro/flavin reductase NfrA1 gi|521289080 B. pumilus NADPH oxidoreductase gi|810478726 E. aurantiacum NADPH oxidoreductase gi|657222032 B. simplex nitro/flavin reductase gi|701524349 B. flexus NADPH oxidoreductase gi|647313151 B. megaterium Mes11 nitroreductase NfrA1 V. harveyi NADPH flavin oxidoreductase FRP gi|3023783 V. parahaemolyticus NADPH flavin oxidoreductase gi|658995544 P. profundum FMN reductase gi|752747281 A. actinomycetemcomitans nitroreductase gi|491714133 P. ananatis nitroreductase A gi|768327329 C. freundii nitroreductase A gi|721589485 E. cloacae nitroreductase A gi|779833156 E. coli NADPH nitroreductase NfsA gi|446111304 S. enterica nitroreductase SnrA gi|4336996 S. maltophilia NADH oxidase gi|491563135 100 99 54 80 88 63 64 81 50 96 53 61 52 92 98 57 83 71 74 95 75 89 73 65 55 66 0.1 NfsA FRP Nitroreductase 4 Arsenite oxidase NfsB like nitroreductase Nitroreductase 1 Firmicutes Cyanobacteria γ - Proteobacteria 9 nitroréductases Type I (oxygen-insensitive) Nitro FMN reductase 5 sous-familles Bacillus sp. Activité nitroréductase sur la mésotrione et le MNBA: 2 enzymes : NfrA1 NfrA2 45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 28 mai 2015, Versailles

Les nitroréductases NfrA1 et NfrA2 de B. megaterium Mes11 Souches dégradant la mésotrione 68.16 % pdb 1ZCH 59.44 % pdb 3N2S 45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 28 mai 2015, Versailles

Reconstruction par homologie Homodimer, 1 FMN / monomer : 249 aa (NfrA1) ou 245 aa (NfrA2) Acides aminés des deux chaines Liaisons avec FMN Exemple de NfrA1 model (SWISS MODEL) 45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 28 mai 2015, Versailles

Caractérisation : optima de pH et température pH optimum 6-6.5 > 60 % activité de 5.5 à 7.5 Temp. optimale 23-25 °C > 60 % activité de 4 °C à 40 °C NfrA2 : > 90 % activité de 4 °C à 37 °C 45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 28 mai 2015, Versailles

Caractérisation : mécanisme réactionnel NfrA1 NADPH dépendante NfrA2 NAD(P)H dépendante Mécanisme de type Bi-Bi ordonné ping-pong 45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 28 mai 2015, Versailles

Caractérisation : mécanisme réactionnel Mécanisme de type Bi-Bi ordonné ping-pong Mesotrione-NO2 Ou MNBA Mesotrione-NHOH / AMBA Ou AMBA NAD(P)H + H+ NAD(P)+ E-FMN E-FMNH2 E-FMN 45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 28 mai 2015, Versailles

Activité nitroréductase Exemple de NfrA2 : AMBA Mesotrione AMBA MNBA 45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 28 mai 2015, Versailles

Voies de biotransformation de la mésotrione Transferts bi électroniques NADPH + H+ NADP+ NADPH + H+ NADP+ NfrA1 NfrA1 NfrA2 NfrA2 Hydroxylamino intermediate Mesotrione NAD(P)H + H+ NAD(P)+ nitroso intermediate NAD(P)H + H+ NAD(P)+ isoxazolol intermediate NAD(P)H + H+ NADPH + H+ NfrA2 NfrA1 NAD(P)+ NADP+ MNBA amino intermediate NAD(P)H + H+ NADPH + H+ NfrA2 NfrA1 NAD(P)+ NADP+ NADPH + H+ NADP+ NADPH + H+ NADP+ NfrA1 NfrA1 NfrA2 NfrA2 nitroso intermediate NAD(P)H + H+ NAD(P)+ NAD(P)H + H+ NAD(P)+ AMBA Hydroxylamino intermediate 45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 28 mai 2015, Versailles

Conclusion Diversité importante des nitroréductases chez B. megaterium 9 enzymes, 5 familles Première identification et caractérisation d’enzyme impliquée dans la transformation de la mésotrione Voie commune de biotransformation chez Bacillus sp. ? 45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 28 mai 2015, Versailles

Perspectives Structure 3D avec ligand - cristallographie Activité sur d’autres nitro-composés - Herbicides - Antibiotiques - Néonicotinoïdes - Pro-drogues 45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 28 mai 2015, Versailles

Merci de votre attention ! Muriel Joly Isabelle Batisson TRICETOX Pascale Besse-Hoggan Merci de votre attention ! 45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 28 mai 2015, Versailles

« magic nitro » Selectivity ratio for insects over vertebrates 565 0.005 Pseudomonas sp. 1G (Pandey et al., 2009) 45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 28 mai 2015, Versailles

Antibody-directed enzyme prodrug therapy Gene (or Virus)-directed enzyme prodrug therapy (de Oliveira et al., 2010) 45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 28 mai 2015, Versailles