de nouvelles activités enzymatiques Peut-on créer de nouvelles activités enzymatiques

Chemicals manufacture Textiles, leather and fur INDUSTRIAL ENZYMES: WORLDWIDE MARKET FORECAST, 1997-2002 ($Million)   4.0 1,820.3 1,557.0 1,498.0 Total 2.7 67.6 60.8 59.2 Chemicals manufacture 6.9 136.0 104.3 97.6 Pulp and paper 2.0 182.7 164.2 161.0 Textiles, leather and fur 4.8 600.9 498.0 475.2 Detergents/cleaners 3.5 833.1 729.7 705.0 Food and animal feed AAGR% 1997-2002 2002 1998 1997 Market Sector

Utilisation des enzymes recombinantes dans l’industrie alimentaire enhances rising of bread dough bacteria or fungi xylanase (hemicellulase) converts starch to simple sugars bacteria pullulanase improves bread dough structure protease improves fruit juice clarity fungi pectinesterase slows staling of breads maltogenic amylase oil and fat modification lipase reduces food deterioration, particularly egg-based products glucose oxidase converts glucose sugar to fructose sugar glucose isomerase improves beer filtration beta-glucanase starch/sugar modification cyclodextrin-glucosyl transferase clots milk protein to make cheese chymosin catalase alpha-amylase removes bitter substances from beer alpha-acetolactate decarboxylase Use (examples) GE Organism Enzyme Name

Les technologies industrielles d’aujourd’hui (synthèse chimique, transformation de produits naturels) utilisent de plus en plus des procédés biologiques. L’amélioration d’un procédé de biotransformation demande une amélioration des enzymes qui le compose. Mais peut-on modifier (tout en les contrôlant) les propriétés biochimiques des enzymes?

Analyse des relations structure-fonctions des protéines Comprendre comment le repliement d’une protéine engendre sa fonction de catalyseur Comprendre les interactions à moyenne et longue distance pour calculer et prédire le repliement (difficile!)

Les solutions (1) Déterminer la structure tridimensionnelle (RX, RMN, autres) Modéliser la protéine (calcul) Introduire les mutations Exprimer, purifier, etc Dans de nombreux cas la (ou les) mutations a (ont) des effets non prévus

Méthode longue, coûteuse et sans garantie de résultats Les solutions (2) Utiliser la biodiversité naturelle pour trouver des propriétés enzymatiques nouvelles (substrats, pH, T, P, cofacteurs, etc) Méthode longue, coûteuse et sans garantie de résultats Les propriétés attendues peuvent être disjointes!!

Méthode alternative? Qui ne nécessite pas forcément de connaître la structure tridimensionnelle de l’enzyme Qui ne se focalise pas sur une partie fine de la protéine Qui intègre l’ensemble de la séquence protéique dans la détermination d’une fonction Qui pourrait mettre en évidence l’ensemble des structures primaires qui permettent la construction d’une fonction (repliement, substrat, dynamique, etc)

L’évolution est lente, elle a besoin de nombreux cycles successifs de diversification et de spécialisation, pour sélectionner une fonction nouvelle. mutagénèse recombinaison crossing-overs reproduction sexuée Génétique substrat réaction cofacteur environnement (pH, T, P) Biochimique

Evolution naturelle Cycles successifs de Modification du matériel génétique Sélection des fonctions nouvelles

Sequence recombination biodiversity natural Single gene Gene family Sequence recombination (DNA shuffling) Random mutagenesis Segment directed biodiversity artificial Function space analysis Functional selection Optimized enzyme Expression Fonctional biodiversity

La recombinaison augmente la vitesse de l’évolution. Générer la diversité La recombinaison augmente la vitesse de l’évolution.

L’évolution combinatoire consiste donc à reproduire l’évolution naturelle avec un seul impératif: ramener quelques million d’années à quelques jours ! Elle est composée comme l’évolution naturelle de cycles de modification du matériel génétique et de sélection de l’information.

Générer la diversité Mutagénèse DNA shuffling Step Itchy Shiprec Scratchy Rachitt Clery L-shuffling Dogs RmPCR Réparation hétéroduplex

Générer la diversité Générer la diversité est la première étape de l’évolution combinatoire. Cette étape dicte le devenir de l’expérience, car c’est de notre aptitude à générer la diversité que l’on pourra chercher des évènements originaux.

Générer la diversité Un peu de théorie: Pour envisager toutes les combinaisons possibles sur un protéine de 500 aa, il faut 19500 combinaisons possibles, soit 3.10650 clones et donc 3.10650 ADNs différents! Le calcul inverse montre qu’avec 1.106 clones, on ne peut muter que 5 positions!

Nombre d’acides aminés changés simultanément Générer la diversité 2x1021 107x109 7 4x1018 9,8x109 6 6x1015 623976948 2476099 5 8,4x1012 27367410 651605 4 9x109 823080 68590 3 7183900 16245 14440 2 3800 190 95 1 Nombre d’acides aminés changés simultanément (M) 20 10 Nombre de positions mutées (N)

Mutagenèse Error-prone PCR Souches mutatrices Générer la diversité Mutagenèse Error-prone PCR polymérases non fidèles variation de [Mg2+] abaissement de la concentration d’un nucléotide Souches mutatrices inactivées dans les systèmes de réparation de l’ADN, elles produisent des plasmides comportant des mutations

Local sequence degeneration CYP101 L A G L - - - - - - - - - - - P E D - - CYP108 A L G V - - - - - - - - - - - P E E - - CYP102 G F - - N Y R F N S F Y R D Q P H P F I E helix E-F loop F helix CYP1A1 202 C F - - G R R Y D H N H Q E - - L L S L- CYP1A2 204 C F - - G Q H F P E S S D E - - M L S L- * * * * * * * * *

Sequence changes compared to parent Saturated segment directed mutagenesis in a 1500 bp long sequence 1A1 CTTTGGCCGGCGCTATGACCACAACCACCAAGAACTGCTTAGCCTAATCA-3’ ..................T...............T...........G.. ........A..A..T.CC.G.G.G.AG.G.C...A.............. 37 .................................................. 36 ........A.....T..CT......AG...C...T............... 21 ..............T.C.T….....AG.G.....T............... 15 ..............T...TG.G........C...T............... 17 ................C.T....G..G.G.C...T............... 29 ...........X..T...T......A....C...T............... 40 ........A..A......T....G......C...T............... 42 ........A.....T.C.TG.....AG...C...T............... 9 ...........A....CCTG...G..........T............... 25 ..............T...T......A....C................... 50 ..............T...TG.G........C...T............... 53 ........A.....T...T...........C...T............... 10 ........A..A....CCT.........G.C...T............... 3 ........A.....T.CCT....G.AG.......T............... 6 ........A..A..T.CCTG........G.C...T............... 38 ........A..A..T.CCTG.G....G...C...T............... 13 ........A..A..T.C.TG........G.C...T............... 19 ........A..A..T...T....G.A....C...T............... 27 ........A..A..T.C.TG...G..........T............... 48 ........A.......CCT....G......C...T............... 1 ..............T..CT.......G.......T............... 23 ..............T.CCT....G..G...C...T............... 7 ........A..A..T.CCT..G....G....................... 14 ........A..A..T..CTG.G........C...T............... Degenerated primer used for PCR Sequence changes compared to parent in functionally competent mutants

In vitro PCR In vivo Generation of segment targeted biodiversity by recombination PCR Degenerated long primer In vitro In vivo Segment targeted library of protein variants

DNA shuffling Générer la diversité gène ancestral La première méthode, décrite par Stemmer en 1994. Il faut des gènes assez homologues pour que le shuffling se fasse. évolution naturelle pool de fragments fragmentation réassemblage

Unique yeast recombination properties Homologous gap repair Identical sequences Single plasmid homeologous recombination Similar sequences Gap repair by homeologous recombination

Functionally competent interspecies and interfamily P450 1A1 P450 1A2 Mouse Rabbit Mouse Functionally competent interspecies and interfamily chimeric P450s obtained only by in vivo recombination in yeast (no PCR step)

Controlled DNAse I digestion In vitro generation of sequence diversity Controlled DNAse I digestion Gene fragments PCR or ligation Shuffled library Gene familly or primary mutants vector Amplification of full length products Cloning DNA shuffling Error prone PCR with primers vector Cloning

STaggered Extension Process Générer la diversité Step STaggered Extension Process Méthode qui utilise les propriétés des polymérases thermostables, nécessite de l’homologie entre les fragments

Rachitt Générer la diversité Random CHImeragenesis on Transient Templates Méthode un peu différentes des autres puisqu’elle ne fait pas appel au réassemblage par des polymérases, mais il faut toujours de l’homologie entre les fragments

Générer la diversité L-shuffling

(Incremential Truncation for the Creation of Hybrid Enzymes) Générer la diversité Itchy (Incremential Truncation for the Creation of Hybrid Enzymes) Méthode qui ne tient pas compte de l’homologie entre les parents, ni de la phase de lecture des gènes NATURE BIOTECHNOLOGY VOL 17 DECEMBER 1999

Réparation hétéroduplex Générer la diversité Réparation hétéroduplex

Controlled DNAse I digestion Size selection of partial CLEARY shuffling method Controlled DNAse I digestion 25-100 bases fragments Long range PCR without primers promoter ORF terminator Yeast -E. coli shuttle vector 11kbp Gene family PCR selection of full length cDNAs * Size selection of partial & full length cDNAs Mutagenesis In vivo recombination “clean” vector Library of mosaics

in vitro + in vivo = more diversity + self-cloning

Example of mosaic P450 sequences following shuffling of human CYP1A family by the CLEARY procedure. P450 1A1 tags P450 1A2 tags Common zone Single point Mutation.

Sélectionner les variants In vitro Ribosome display Phage display Microencapsulation In vivo Yeast display Cribles fonctionnels Cell sorting, FRET, High- Troughput Screening

hat ou et s hat ou creened or! Sélectionner les variants Méthodes in vitro La sélection C’est une étape critique Elle doit être ajustée finement hat ou et s hat ou creened or!

Sélectionner les variants Méthodes in vitro Ribosome display

Sélectionner les variants Méthodes in vitro Microencapsulation

Sélectionner les variants Méthodes in vitro Phage display

Sélectionner les variants Méthodes in vivo Yeast surface display

Sélectionner les variants Méthodes in vivo Cell-sorting FRET

Sélectionner les variants Méthodes in vivo Crible fonctionnel C’est le crible le plus simple à mettre en œuvre: Il permet de trier un très grand nombre de cellules (entre 1x105 et 1x107 cellules par cycle) Le lien entre l’ADN et le phénotype est conservé L’activité est directement testable par: la résistance (antibiotique, etc) la prototrophie (vitamine, acide aminé, etc) l’activité de transformation : d’un susbstrat en produit coloré ou fluorescent d’un susbstrat toxique en un produit innofensif d’un susbstrat innofensif en un produit toxique

Sélection sur l’activité Sélectionner les variants Méthodes in vivo Sélection sur l’activité

Sélection sur l’activité Sélectionner les variants Méthodes in vivo Sélection sur l’activité

Un exemple d’évolution combinatoire:

Diversité générée par Error- Prone PCR et DNA shuffling Screening de l’activité directement sur cellules en présence du substrat

Cartographie des mutations obtenues: aurait- on pu les prédire? Une bonne diversité Cartographie des mutations obtenues: aurait- on pu les prédire?

Conclusions L’évolution combinatoire est une méthode nouvelle dont les applications industrielles sont importantes. Il existe plusieurs enzymes issues de ces techniques qui sont déjà commercialisées. Il y a plusieurs sociétés de biotechnologies dont l’activité principale est la recherche de biodiversité sous toutes ces formes: Maxygen, Diversa, Genencore, Novozyme, Enchira, Proteus etc. Les secteurs d’activité de la santé sont aussi impliqués, avec la fabrication de vaccins, d’anticorps monoclonaux.

Sites Web à voir: www.maxygen.com www.proteus.com www.enchira.com www.novozymes.com www.genencor.com www.diversa.com www.che.caltech.edu/groups/fha/Enzyme/directed.html