Expression, purification et analyse structurale des protéines membranaires Plan des 4 heures de cours: Qu’est ce qu ’une protéines membranaire? Localisation Fonctions Propriétés intrinsèques Conséquences sur l’étude structurale de ces protéines Expression hétérologue des protéines membranaires Purification des protéines membranaires Préparation des extraits membranaires Solubilisation des protéines membranaires Chromatographies Premières structures obtenues à partir de Protéines Membranaires mammifères produites en système hétérologue (en 2005) 5. Facteurs limitant la cristallisation des protéines membranaires

3. Purification des protéines membranaires 3. 1. Préparation d’extraits membranaires Suivant le système d’expression: Bactéries: pression mécanique avec Presse de French Levures: broyage mécanique avec billes de verre Cellules d’insecte ou de mammifère: choc osmotique En présence de tampon et d’inhibiteurs de protéases. Centrifugation basse vitesse pour éliminer les cellules non cassées et les noyaux Centrifugation haute vitesse (100 000 g) du surnageant pour récupérer les membranes Re-suspension du culot Centrifugations haute vitesse (100 000 g) pour débarrasser les membranes des protéines non membranaires

3. Purification des protéines membranaires 3. 2. Solubilisation des protéines membranaires Les protéines membranaires sont difficiles à solubiliser et à maintenir en solution à cause de leur caractère hautement hydrophobe Cela requiert des détergents: Petites molécules amphipatiques qui s’auto-associent pour former des micelles en milieu aqueux au-delà d’une certaine concentration dite “critical micelle concentration, CMC”; contrairement aux lipides qui s’associent pour former des bicouches (vésicules) Micelle de détergents Vésicules lipidique

3. Purification des protéines membranaires 3. 2. Solubilisation des protéines membranaires L’extrémité hydrophobe des détergents se lient aux régions hydrophobes des protéines membranaires, déplaçant ainsi les molécules lipidiques L’extrémité polaire du détergent va tapisser la surface en contact avec le milieux aqueux. La protéine est ainsi maintenue en solution sous la forme d’un complexe détergent-protéine Les détergents sont soit ioniques, non-ioniques ou zwiterioniques en fonction de la nature de leur partie polaire anioniques: SDS, cholate de sodium, déoxycholate Switerioniques: CHAPS Non-ioniques: Triton X-100, digitonine, Octyl-glucoside, Dodécyl-maltoside Ils auront aussi un caractère plus ou moins solubilisant vis-à-vis des membranes et dénaturant vis-à-vis des protéines

3. Purification des protéines membranaires 3. 2. Solubilisation des protéines membranaires Structure des détergents et « micellarisation » Micelles de b-Octyl-glucoside La nature et par conséquent le comportement de tel ou tel détergent aura un impact important et décisif dans les différentes étapes de solubilisation, purification et cristallisation des protéines membranaires, ainsi que leur reconstitution.

3. Purification des protéines membranaires 3. 3. Chromatographies La chromatographie est une technique d'analyse qualitative et quantitative dans laquelle l'échantillon contenant une ou plusieurs espèces est entraîné par un courant de phase mobile (liquide, ou gaz) le long d'une phase stationnaire (papier, gélatine, silice, polymère, silice greffée etc). Chaque espèce se déplace à une vitesse propre dépendant de ses caractéristiques et de celles des deux phases. La chromatographie repose sur l'entraînement d'un échantillon dissous par une phase mobile à travers une phase stationnaire. Celle-ci retient plus ou moins fortement les substances contenues dans l'échantillon dilué selon l'intensité des forces d'interactions de faible énergie (comme les forces de Van der Waals, les liaisons hydrogène, etc.) réalisées entre les différentes espèces moléculaires et la phase stationnaire.

3. Purification des protéines membranaires 3. 3. Chromatographies Classification des chromatographies en fonction des mécanismes de séparation : Les facteurs qui interviennent dans le partage des molécules à séparer entre les phases fixe et mobile sont : la solubilité dans un solvant liquide, la taille (la forme), la polarité, la charge électrique, la présence de groupernents d'atomes formant des sites particuliers. Les différents types de chromatographie résultent du fait que l'on a privilégié l'effet de l'un de ces facteurs, mais l'exclusivité d'un mécanisme n'est jamais totale au cours d'une séparation chromatographique. Plusieurs sortes de chromatographies en phase liquide: échange d’ions : séparation en fonction de la charge des protéines d’exclusion : séparation en fonction de la masse des protéines d’affinité : rétention par affinité pour un ligand, un métal, ….

3. Purification des protéines membranaires 3. 3. Chromatographies 3. 3. 1. Chromatographie d’affinité La phase stationnaire est un support macromoléculaire chimiquement inerte, sur lequel est greffé un effecteur qui présente une affinité biologique (bio-affinité) pour un soluté de l'échantillon à analyser (affinité enzyme-substrat, ligand-récepteur, antigène-anticorps). Pour un ligand: couplage du ligand sur des billes de sépharose Permet de retenir sur colonne uniquement la fraction fonctionnelle de la protéine d’intérêt Utilisée plutôt en dernière étape de purification (assez coûteux)

3. Purification des protéines membranaires 3. 3. Chromatographies 3. 3. 1. Chromatographie d’affinité Pour une étiquette ajoutée à la protéine d’intérêt: Cela implique la production de protéines chimériques possédant des étiquettes hexahistidine, GST, domaine calmoduline, streptavidine, …. , qu'on peut alors purifier sur des colonnes contenant les ligands appropriés pour ces étiquettes : - Nickel pour l’étiquette hexahistidines - Glutation pour la GST - Calmoduline pour le domaine d’interaction à la calmoduline - Biotine pour la streptavidine Pour cela, il faut introduire à l’une des extrémités du gène de la protéine d’intérêt la séquence codant pour l’étiquette choisie et exprimer la protéine chimérique dans le système d’expression choisi.

3. Purification des protéines membranaires 3. 3. Chromatographies 3. 3. 1. Chromatographie d’affinité Ex. Protéines portant une étiquette 6-Histidines: Utilisation de billes d’agarose avec groupement NTA capable de chélater le Ni2+: NTA Support Protéine + 6 His

3. Purification des protéines membranaires 3. 3. Chromatographies 3. 3. 1. Chromatographie d’affinité Ex. Protéines portant une étiquette 6-Histidines:Utilisation de billes d’agarose avec groupement NTA capable de chélater le Ni2+ Autres utilisations:

Solubilisation Purification Reconstitution Analyse Structurale : RMN, 3D cristallographie, EM (analyse de particules uniques) Analyse fonctionelle 2D Cristallographie Reconstitution Removal of detergent Analyse fonctionelle

produites en système hétérologue (en 2005) 4. Premières structures obtenues à partir de Protéines Membranaires mammifères produites en système hétérologue (en 2005) 1. ATPase calcium du réticulum sarcoplasmique du muscle de lapin (SERCA 1A) Expression dans la levure S. cerevisiae de la protéine recombinante portant à son extrémité carboxy-terminale un domaine accepteur de biotine pour purification sur résine d’affinité streptavidine Purification en Dodecyl Maltoside puis en C12E8 Cristallisation en C12E8 Crystallization of a mammalian membrane protein overexpressed in Saccharomyces cerevisiae Marie Jidenko, Rikke C. Nielsen, Thomas Lykke-Møller Sørensen, Jesper V. Møller, Marc le Maire, Poul Nissen, and Christine Jaxel¶, PNAS 2005

produites en système hétérologue (en 2005) 4. Premières structures obtenues à partir de Protéines Membranaires mammifères produites en système hétérologue (en 2005) 2. Canal potassium voltage dépendent de rat (Kv1.2) Expression dans la levure P. pastoris du canal recombinant et de l’oxido-réductase b portant à leur extrémité carboxy-terminale une étiquette 6-histidines pour purification sur résine d’affinité Ni-NTA Purification en Dodecyl Maltoside puis en C12E8 Cristallisation en Dodecyl Maltoside Canal Kv1.2 Oxido-réductase Crystal Structure of a Mammalian Voltage-Dependent Shaker Family Kþ Channel Stephen B. Long, Ernest B. Campbell, Roderick MacKinnon Science 2005