Programme de recherche sur les gènes modificateurs dans la mucoviscidose Harriet Corvol Centre de Ressources et de Compétences pour la Mucoviscidose Service de Pneumologie Pédiatrique Centre de référence des maladies respiratoires rares Inserm UMR S-938 Hôpital Armand Trousseau, Paris Inserm Institut national de la santé et de la recherche médicale 1

Recherche de gènes modificateurs dans la mucoviscidose Base de travail Expression très hétérogène de la maladie chez les patients porteurs des mêmes mutations de CFTR Exemple : atteinte pulmonaire Gène CFTR Gènes modificateurs Poumon Foie Intestin Pancreas Glandes sudoripares Tractus génital Heritability of lung disease severity in CF Twin A Twin B Monozygote Twins Siblings Sibling B Sibling A Cutting, 2007 2

Les points essentiels Patients parfaitement phénotypés Large cohorte pour une étude génome entier Réplication dans des cohortes indépendantes 2

Le programme Etape 2 Extraction et stockage de l’ADN Prélèvement sanguin Etape 5 Analyse du génome entier Dossier patient informatisé Etape 3 Recueil des données cliniques dans la base nationale MucoNat Etape 1 Inclusion des patients dans les CRCM Etape 4 Analyses phénotypiques Etape 6 Analyses d’association génotype/phénotype

Etapes 1 & 2 Inclusions des patients Prélèvement sanguin lors d’un bilan annuel du patient Collections gérées par le Généthon Banque d’ADN et de cellules (Dr. Saker) Inclusions des patients débutées en décembre 2006 dans les différents CRCM Etat des lieux décembre 2009 2590 inclusions Prévisions décembre 2010 3500 inclusions 25 20

Recueil des données phénotypiques dans la base nationale MucoNat Etape 3 Recueil des données phénotypiques dans la base nationale MucoNat Sélection des données phénotypiques à importer Interfaçages entre les différents logiciels de suivi des patients (e-muco, Mucodomeos et Gulper) et la base MucoNat Jean-François Vibert Inserm UMR-S707 25 20

Analyse du phénotype respiratoire Etape 4 Analyse du phénotype respiratoire Sélection d’extrêmes Chez des patients homozygotes DF508 D’origine européenne Ayant au moins 5 ans de suivi de VEMS Phénotype modéré VEMS Phénotype sévère Pierre-Yves Boelle Inserm UMR-S707 Âge (années) 25 20

Analyse du génome entier : étude pilote Etape 5 Analyse du génome entier : étude pilote Puce de génotypage contenant 350 000 SNPs : > 318 000 tagSNPs (HapMap) + 7 500 SNPs non synonymes 140 patients de phénotype respiratoire sévère Comparaison 130 patients de phénotype respiratoire modéré Diana Zelenika, Simon Heath CNG, Evry 25 20

Les résultats préliminaires 14 régions d’ADN associées à la sévérité de l’atteinte respiratoire avec P<10-5 Pour ce type d’analyse : P< 10-7 En particulier loci sur Kr 5, 12 et 14 Pierre-Yves Boelle Inserm UMR-S707 25 9 20

Whole genome & CF : Projet Nord-Américain Associe les équipes Nord-Américaines - Johns Hopkins University (Garry Cutting) University of North Carolina and Case Western Reserve Univerity (Mike Kwowles, Mitchell Drumm) Hospital for Sickkids, Toronto (Peter Durie) 25 10 20

Garry Cutting (Johns Hopkins University ) Whole genome & CF Garry Cutting (Johns Hopkins University ) Cohorte de familles : 350 frères et sœurs + parents (tous génotypes de CFTR) Analyse de liaison pour identifier les régions du génome communes dans les fratries avec même degré d’atteinte respiratoire Association avec la sévérité de l’atteinte respiratoire Kr 5 (90cM et 190cM) Kr 12 Kr 14 25 20 11

Garry Cutting (Johns Hopkins University ) Whole genome & CF Garry Cutting (Johns Hopkins University ) Kr 5;190cM : liaison indépendante des mutations de CFTR et de variables pouvant moduler le VEMS (BMI, statut pancreatique, pyo, sexe) = région influençant la fonction respiratoire uniquement Kr 5;90cM, Kr 12 et 14 : liaison diminuée en prenant en compte le BMI = régions influençant la fonction resp & le BMI 25 12 20

Garry Cutting (Johns Hopkins University ) Whole genome & CF Garry Cutting (Johns Hopkins University ) Kr 5 Recherche de gènes candidats au sein des 2 régions - 21 gènes candidats autour du pic 90cM et - 5 gènes candidats autour du pic 190cM Génotypage d’« haplotype tagging SNPs » Analyse de liaison (TDT, programme FBAT) 2 SNPs dans le gène de la calpastatine (CAST) (5q15) = inhibiteur de calpaïne (calcium-dependent cysteine protease) 25 13 20

Calpaïnes-Calpastatine Noyau Cytoplasme Cytokines pro-inflammatoires IkB NF-kB Ca2+ Calpaïne Calpastatine

Calpaïnes-Calpastatine & CF Altznauer et al, JBC 2004 Calpain-1 regulates Bax and subsequent Smac-dependent caspase-3 activation in neutrophil apoptosis Neutrophiles sanguins patients CF / sujets sains - Apoptose retardée - calpastatine +  calpaine 25 15 20

Whole genome & CF Genome-wide SNP (Affymetrix 100K) Mike Kwowles (University of North Carolina) Mitchell Drumm (Case Western Reserve Univerity) Christopher L. Karp (University of Cincinnati) Genome-wide SNP (Affymetrix 100K) 320 patients de la cohorte GMSG (homozygotes DF508) 160 atteintes respiratoires sévères 160 atteintes respiratoires modérés ADN poolés par 20 / arrays 25 20 16

Whole genome & CF Association avec la sévérité de l’atteinte respiratoire > 2000 SNPs dans 6 régions dont Kr7, proche de CFTR Gu et al., Nature 2009 ‘Top’ gene : IFRD1 = interferon-related developmental regulator 7q22-q31 25 20 17

Whole genome & CF Screening IFRD1 Réplication dans une autre cohorte (Cutting, familles) Gu et al., Nature 2009 25 18 20

IFRD1 Action dépendante des histone deacetylase (HDAC) Impliqué dans la différentiation cellulaire et la réponse au stress Expression importante dans les cellules sanguines, en particulier neutrophiles Gu et al., Nature 2009 25 20 19

Neutrophiles des souris ifrd1 -/-  Bactéricidie anti-P.aeruginosa  Production LPS-induite de TNF-a Gu et al., Nature 2009 25 20 20

Le programme Etape 2 Extraction et stockage de l’ADN Inclusion des patients dans les CRCM Dossier patient informatisé Etape 3 Recueil des données cliniques dans la base nationale MucoNat Etape 4 Analyses phénotypiques Etape 2 Extraction et stockage de l’ADN Prélèvement sanguin Etape 5 Analyse du génome entier Etape 6 Analyses d’association génotype/phénotype

Analyses d’association génotype / phénotype Etape 6 Analyses d’association génotype / phénotype Jean-François Vibert Pierre-Yves Boelle Inserm UMR-S707 Sélection des caractères phénotypiques à analyser à partir de la base nationale MucoNat en fonction des questions spécifiques posées Sévérité de l’atteinte respiratoire Précocité de la colonisation respiratoire par Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, … Survenue/Sévérité d’une atteinte hépatique Survenue/Sévérité d’un diabète … 25 20

Réplication dans des cohortes indépendantes Perspectives Réplication dans des cohortes indépendantes Europe : Consortium européen en cours d’élaboration Equipes déjà impliquées : Stuart Elborn : Irlande du Nord Ed McKone : Irlande du Sud Anil Metha : Ecosse Harry Cuppens : Belgique Giulio Cabrini : Italie Collaborations avec le consortium américain à mettre en place (G. Cutting, M.Knowles, M. Drumm, P. Durie) 25 20

Gènes modificateurs dans la mucoviscidose : les acteurs Toutes les équipes médicales des CRCM Inclusion des patients Coordination par des chargés de mission Alexandra Blondel Stéphane Mazur Recueil des données phénotypiques Création de la base de données informatique (MucoNat) Jean François Vibert Michèle Boulé Gestion de l’utilisation d’e-muco dans les CRCM Delphine Michon Pauline Touche Pierre Yves Boëlle (biostatisticien) Analyse des données phénotypiques Généthon – Safa Saker Collecte et gestion des prélèvements sanguins Centre National de Génotypage – Diana Zelenika, Simon Heath Etudes génétiques Datamanager Malika Mahloul 1

Gènes modificateurs dans la mucoviscidose Un point sur les financements actuels Contrats ANR 2006-2009 (A. Clement) & 2010-2012 (H. Corvol) Centre National de Génotypage (avis favorable du conseil scientifique 2007) Réseau de Recherche Clinique Inserm 2006 1 25