Génétique et biotechnologie Chapitre 2 titre 3ème partie Génétique et biotechnologie

PLAN plan 1. Mécanisme de réplication. 1.1. Principe. 1.2. Mise en évidence. 1.3. Les étapes de la synthèse. 1.4. Mitose et réplication. 2. Les mutations. plan 2.1. Rappel : la traduction. 2.2. Type de mutations. 3. ADN: outil biotechnologique. 3.1. Empreinte génétique. 3.2. Thérapie génique. 3.3. OGM. 4. Génétique des populations. 4.1. Principe. 4.2. Filiation.

1.1 1. Mécanisme de réplication. 1.1. Principe. T A G C A T C G T A G Réplication semi-conservative: copie par hybridation de chaque brin d’ADN. 5’ T A G C 3’ 3‘ A T C G 5’ 5’ T A G C 3’ 3’ A T C G 5’ 1.1 L’enzyme responsable de ce type de réaction est une DNApolymérase DNA dépendante. PLAN 3

1.2 1. Mécanisme de réplication. 1.2. Mise en évidence. PLAN 4 Expérience de Meselson On cultive des bactéries sur un milieu contenant du 15N 1.2 Les bactéries synthétisent du 15N-ADN Le 15N-ADN est plus lourd que le 14N-ADN « naturel » 14N-ADN 14N15N-ADN On transfert les bactéries sur un milieu contenant du 14N 15N-ADN Les nouvelles bactéries Synthétisent du 14N-ADN On mesure la densité de l’ADN toutes les 20 mn. PLAN 4

1.2 1. Mécanisme de réplication. 1.2. Mise en évidence. PLAN 5 Expérience de Meselson A t= 0, l’ADN est du 15N 1.2 15N-ADN 14N-ADN 14N15N-ADN A t = 20 mn l’ADN est un hybride 15N (matrice) et 14N (néoformé). A t = 40 mn on obtient un mélange 14N (néoformé) et d’hybride. Les molécules d’ADN sont formées par un brin parental (matrice) et un brin néoformé. PLAN 5

1.3 1. Mécanisme de réplication. 1.3. Les étapes de la synthèse. La double hélice est déroulée par des hélicases. Les brins se séparent et sont stabilisés par les protéines fixatrices d’ADN monocaténaire. Une amorce en ARN (fragment d’Okazaki) est synthétisée par l’ADN primase 1.3 L’ADN polymérase synthétise le brin dans le sens 5’ --> 3’ à partir de l’amorce. - Synthèse en continue pour le brin 5’ --> 3’ - Synthèse discontinue pour le brin 3’ --> 5’ Au cours de l’élongation, la polymérase remplace le fragment d’Okazaki qui la précède. Les fragments sont liés par une ligase. PLAN 6

1.4 1. Mécanisme de réplication. 1.4. Mitose et réplication. G2 S M G1 La réplication est la première étape de la division cellulaire. 1.4. Mitose et réplication. Elle se déroule à la fin de l’interphase, avant la condensation de la chromatine en chromosome. On peut distinguer 4 phases du cycle par rapport à la réplication. 1.4 Masse arbitraire en ADN t (en h) 2 1 3 6 9 G2 S M Condensation de la chromatine G1 G1 anaphase Interphase mitose Interphase PLAN 7

Changement d’un acide aminé 2. Les mutations. 2.1. Mutations ponctuelles. matrice TA .TAC. AAA.CCT .GCC. CTC.ATT.TG TA .TAC. AAA.TCT .GCC. CTC.ATT.TG Brin complémentaire AT .ATG.TTT .GGA.CGG.GAG.TAA.AC AT .ATG.TTT .AGA.CGG.GAG.TAA.AC 2.2.1 AU.AUG.UUU.GGA.CGG.GAG.UAA.AC AU.AUG.UUU.AGA.CGG.GAG.UAA.AC ARNm Séquence protéique Met - Phe - Gly - Trp - Glu - stop Met - Phe - Arg - Trp - Glu - stop Changement de base Changement d’un acide aminé PLAN 8

Changement d’un acide aminé 2. Les mutations. 2.1. Mutations ponctuelles. matrice TA .TAC. AAA.TCC .GCC. CTC.ATT.TG TA .TAC. AAA.TCT .GCC. CTC.ATT.TG Brin complémentaire AT .ATG.TTT .AGA.CGG.GAG.TAA.AC AT .ATG.TTT .AGG.CGG.GAG.TAA.AC 2.2.1 AU.AUG.UUU.AGG.CGG.GAG.UAA.AC AU.AUG.UUU.AGA.CGG.GAG.UAA.AC ARNm Séquence protéique Met - Phe - Gly - Trp - Glu - stop Met - Phe - Arg - Trp - Glu - stop Changement de base Changement d’un acide aminé Mutation silencieuse Pas de changement PLAN 9

Changement d’un acide aminé 2. Les mutations. 2.1. Mutations ponctuelles. matrice TA .TAC. AAA.TCT .GCC. CTC.ATT.TG TA .TAC. AAA.ACT .GCC. CTC.ATT.TG Brin complémentaire AT .ATG.TTT .TGA.CGG.GAG.TAA.AC AT .ATG.TTT .AGA.CGG.GAG.TAA.AC 2.2.1 AU.AUG.UUU.AGA.CGG.GAG.UAA.AC AU.AUG.UUU.UGA.CGG.GAG.UAA.AC ARNm Séquence protéique Met - Phe - Gly - Trp - Glu - stop Met - Phe - stop Changement de base Changement d’un acide aminé Mutation silencieuse Pas de changement Protéine tronquée PLAN 10

Un cas pathologique: la drépanocytose. 2. Les mutations. Un cas pathologique: la drépanocytose. 2.1. Mutations ponctuelles. * Nature de la maladie La drépanocytose résulte d'une anomalie de la forme des globules rouges qui lui vaut le nom d'anémie falciforme. 2.2.1 Les globules rouges malades se déforment sous faible pression d'oxygène. Ils sont anormalement fragiles et subissent une destruction rapide. Il en résulte une anémie sévère et des complications vasculaires variées qui conduisent à une mort précoce. L’origine de la maladie provient de la synthèse d’une hémoglobine anormale. PLAN 11

Un cas pathologique: la drépanocytose. 2. Les mutations. Un cas pathologique: la drépanocytose. 2.1. Mutations ponctuelles. * L’hémoglobine. L’électrophorèse de l’hémoglobine permet de mettre en évidence la présence d’une hémoglobine anormale, HbS. 2.2.1 Hémoglobine témoin HbA Malade 1 HbS homozygote Malade 2 HbA + HbS hétérozygote PLAN 12

Un cas pathologique: la drépanocytose. 2. Les mutations. Un cas pathologique: la drépanocytose. 2.1. Mutations ponctuelles. * L’hémoglobine. On soumet l’hémoglobine à une hydrolyse partielle puis à une électrophorèse suivie d’une chromatographie (technique à 2 dimensions). 2.2.1 On constate la présence d’un peptide différent dans la cas de HbS, à la suite d’une hydrolyse partielle. Le séquençage de la protéine permet de mettre en évidence la modification d’un acide aminé. Le Glu présent en 6ème position sur la chaîne b est remplacé par une Val.  La différence de séquence doit être très limitée. PLAN 13

2.2.1 2. Les mutations. Un cas pathologique: la drépanocytose. 2.1. Mutations ponctuelles. * L’origine génétique. sain malade Le gène responsable de la maladie est récessif. 1 2 3 4 5 2.2.1 Les parents sont tous les deux porteurs sains. Hétérozygotes. La fille malade est homozygotes. PLAN 14

Un cas pathologique: la drépanocytose. 2. Les mutations. Un cas pathologique: la drépanocytose. 2.1. Mutations ponctuelles. * L’origine génétique. sain malade On soumet les fragments d’ADN portant les gènes de l’hémoglobine à l’action d’enzymes de restrictions. 1 2 3 4 5 2.2.1 Une enzyme de restriction est une protéine qui peut couper un fragment d'ADN au niveau d'une séquence de nucléotides caractéristique appelée site de restriction. Chaque enzyme de restriction reconnaît ainsi un site spécifique.  Si deux brin d’ADN présentent la même séquence, ils sont coupés au même endroit. A contrario, s’ils donnent les même types de fragments nucléotidiques, on en déduit qu’ils possèdent la même séquence. PLAN 15

2.2.1 2. Les mutations. Un cas pathologique: la drépanocytose. 2.1. Mutations ponctuelles. * L’origine génétique. sain malade On soumet les fragments d’ADN portant les gènes de l’hémoglobine à l’action d’enzymes de restrictions. Les fragments d’ADN obtenus sont séparés par électrophorèse. 1 2 3 4 5 2.2.1 1 2 3 4 5 Une enzyme de restriction est une protéine qui peut couper un fragment d'ADN au niveau d'une séquence de nucléotides caractéristique appelée site de restriction. Chaque enzyme de restriction reconnaît ainsi un site spécifique.  Si deux brin d’ADN présentent la même séquence, ils sont coupés au même endroit. A contrario, s’ils donnent les même types de fragments nucléotidiques, on en déduit qu’ils possèdent la même séquence. Les porteurs sains (1, 2 et 5) possèdent les deux types d’allèles. Le malade (3) possède uniquement l’allèle qui donne un fragment de 1,35 kb On observe deux types de fragments: - 1 fragment de 1,35 kb - 2 fragments de 1,15 et 0,2 kb PLAN 16

2.2.1 2. Les mutations. Un cas pathologique: la drépanocytose. 2.1. Mutations ponctuelles. * La mutation. On procède au séquençage du gène codant pour l’hémoglobine. On soumet les fragments d’ADN portant les gènes de l’hémoglobine à l’action d’enzymes de restrictions. Séquence normale CAT GTA GTG CAC GAG CTC TGA ACT GGT CCA C - - G - - ADN matrice ADN complémentaire GUA CUC ACU GUG ARNm Val His Leu Thr Pro - Protéine Séquence anormale CAT GTA GTG CAC GAG CTC TGA ACT GGT CCA C - - G - - ADN matrice ADN complémentaire GUA CUC ACU ARNm Val His Leu Thr Pro Glu - Protéine 2.2.1 PLAN 17

2.2.2 2. Les mutations. 2.2. Modification de séquence. matrice TA .TAC. AAA. CTG.CCC.TCA.TTT.G TA .TAC. AAA.TCT .GCC. CTC.ATT.TG Brin complémentaire AT .ATG.TTT .AGA.CGG.GAG.TAA.AC AT .ATG.TTT . GAC.GGG.AGT.AAA.C 2.2.2 AU.AUG.UUU. GAC.GGG.AGU.AAA.C AU.AUG.UUU.AGA.CGG.GAG.UAA.AC ARNm Séquence protéique Met - Phe - Arg - Trp - Glu - stop Met - Phe - Asp - Gly - Ser – Lys - … Délétion: élimination d’un ou plusieurs nucléotides. Changement de la séquence de la protéine Décalage du cadre de lecture. PLAN 18

2.2.2 2. Les mutations. 2.2. Modification de séquence. Le principe est le même dans le cas d’une insertion (addition d’un ou plusieurs nucléotides). matrice TA .TAC. AAA. GCC.CTC.ATT.TG TA .TAC. AAA.TCT .GCC. CTC.ATT.TG Brin complémentaire AT .ATG.TTT .AGA.CGG.GAG.TAA.AC AT .ATG.TTT . CGG.GAG.TAA.AC 2.2.2 AU.AUG.UUU.AGA.CGG.GAG.UAA.AC AU.AUG.UUU. CGG.GAG.UAA.AC ARNm Séquence protéique Met - Phe - Arg - Trp - Glu - stop Met - Phe - - Trp - Glu - stop Délétion: élimination d’un ou plusieurs nucléotides. Changement de la séquence de la protéine Décalage du cadre de lecture. Cas d’une délétion de trois nucléotides. Perte d’un acide aminé PLAN 19

Un cas pathologique: la mucovicidose. 2. Les mutations. Un cas pathologique: la mucovicidose. 2.2. Modification de séquence. * Nature de la maladie. La mucoviscidose (pour « maladie des mucus visqueux » en français) est une maladie génétique, affectant les épithéliums glandulaires de nombreux organes. 2.2.2 Elle est liée à des mutations du gène CFTR sur le chromosome 7, entraînant une altération de la protéine CFTR (sigle pour cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). Cette protéine est un canal ionique perméable au chlore, au thiocyanate7 dont la fonction est de réguler le transport du chlore à travers les membranes cellulaires. Son dysfonctionnement provoque une augmentation de la viscosité du mucus et son accumulation dans les voies respiratoires et digestives. La maladie touche de nombreux organes mais les atteintes respiratoires sont prédominantes et représentent l'essentiel de la morbidité. D'évolution chronique et progressive, la maladie s'exprime souvent tôt dès la petite enfance. PLAN 20

Un cas pathologique: la mucovicidose. 2. Les mutations. Un cas pathologique: la mucovicidose. 2.2. Modification de séquence. * Aspect génétique. La majorité des mutations du gène CFTR situé sur le chromosome 7 sont des mutations ponctuelles. Les plus fréquentes sont: des mutations faux-sens (42 %) des micro-insertions et des micro-délétions (24 %) des mutations non-sens (16 %) des mutations d'épissage (16 %) des délétions d'un acide aminé (2 %). On rapporte également quelques grandes délétions. 2.2.2 PLAN 21

Un cas pathologique: la mucovicidose. 2. Les mutations. Un cas pathologique: la mucovicidose. 2.2. Modification de séquence. * Aspect génétique. Les mutations du gène CFTR sont regroupées en 6 classes en fonction des conséquences fonctionnelles qu'elles occasionnent. Certaines mutations entraînent des anomalies quantitatives ou qualitatives sur la protéine CFTR: 2.2.2 Classe 1 : mutations altérant la production de la protéine CFTR. Classe 2 : mutations perturbant le processus de maturation cellulaire de la protéine CFTR. Classe 3 : mutations perturbant la régulation du canal chlorure. Classe 4 : mutations altérant la conduction du canal chlorure. Classe 5 : mutations altérant la stabilité de l'ARNm CFTR. Classe 6 : mutations altérant la stabilité de la protéine mature. PLAN 22

Un cas pathologique: la mucovicidose. 2. Les mutations. Un cas pathologique: la mucovicidose. 2.2. Modification de séquence. * Aspect génétique. La mutation la plus fréquente est la mutation « Delta F508 » (ΔF508) qui consiste en une délétion de trois nucléotides au niveau du dixième exon du gène, aboutissant à l'élimination d'un acide aminé, la phénylalanine, en position 508.  2.2.2 Séquence normale -T TGT GGT TTC TAC TAT AAA AGA AA- ADN non transcrit - Cys Gly Phe Tyr Lys Arg Protéine Séquence anormale PLAN 24

3.1.1 3. ADN: outil biotechnologique. 3.1. Empreinte génétique. Empreinte génétique: analyse des séquences d’ADN spécifiques d’un individu. 3.1.1. Technique. 3.1.1 Cette étude consiste à établir la séquence ADN de certaines portions judicieusement choisies, du génome. Prélèvement d’un échantillon. Purification de l’ADN Amplification (PCR) Séquençage PLAN 24

Répétitions de séquences de 10 à 100 nucléotides 3. ADN: outil biotechnologique. 3.1. Empreinte génétique. Il existe sur l'ADN des portions qui ne codent pour aucune protéine. Certaines d'entre elles, présentent des répétitions. Elles sont appelées les microsatellites et minisatellites. Ces séquences sont très variables selon les individus. 3.1.1. Séquence répétitives. 3.1.1 Microsatellite (STR, pour Short Tandem Repeats) CTGG CTGG CTGG CTGG CTGG CTGG Minisatellite (VNTR, pour « Variable Number Tandem Repeats ») Répétitions de séquences de 10 à 100 nucléotides PLAN 25

3.1.2 3. ADN: outil biotechnologique. 3.1. Empreinte génétique. 3.1.2. ADN mitochondrial. Cet ADN est moins variable que l’ADN chromosomique. Cette étude ne peut pas déterminer si un échantillon provient d'une unique personne. On pourra toujours proposer une probabilité que l'échantillon provienne d'un individu précis, mais cela ne constitue pas une preuve certaine. En revanche, si on obtient 2 ADNmt différents on peut être sûr qu'il ne s'agit pas de la même personne. 3.1.2 Les médecins légistes étudient les sites HV1 et HV2 de l'ADNmt. Ce sont des séquences hypervariables (HV) dont les différentes versions sont nombreuses et avec des fréquences relativement faibles (quelques % de la population générale). Avantage de cette méthode. Pour des échantillons fortement dégradés ou sur un cheveu sans bulbe, il est parfois impossible d'obtenir un profil complet de tous les microsatellites. Dans ce cas, on peut utiliser l'ADN mitochondrial car il y en a de nombreuses copies dans une cellule, tandis qu'il y a rarement plus de 1 ou 2 copies de l'ADN nucléaire. PLAN 26

3.1.3 3. ADN: outil biotechnologique. 3.1. Empreinte génétique. 3.1.3. Chromosome Y. Il existe sur le Chromosome Y des régions hypervariables, nommées STRY. 3.1.3 Inconvénient: Le chromosome Y n'est présent que chez les individus de sexe masculin. Il ne pourra être effectué sur une femme. Avantage: Le chromosome Y est transmis par le père, et l’analyse de ce chromosome permet de faire les tests de paternité, lorsque le père n'est plus vivant. PLAN 27

3.1.4 3. ADN: outil biotechnologique. 3.1. Empreinte génétique. 3.1.4. Analyse ADN et justice. Il existe un certain nombre de limitation dans l’utilisation d’une analyse ADN dans une enquête. 3.1.4 Erreur pendant l’analyse. Mauvaise interprétation des résultats. Contamination de l’échantillon. Etendue de la base de données. La présence de l’ADN d’un suspect sur une scène de crime ne signifie pas automatiquement la participation au crime. Dépôt de faux échantillons d’ADN par le criminel PLAN 28

3.2.1 3. ADN: outil biotechnologique. 3.2. Thérapie génique. 3.2.1. Principe. La thérapie génique utilise des acides nucléiques (ADN ou ARN) pour soigner ou prévenir des maladies. Selon la pathologie, cet objectif peut être atteint en délivrant aux cellules : 3.2.1 un gène fonctionnel qui remplace le gène défectueux à l’origine de la maladie (transgène). un gène à action thérapeutique de l’ARN capable de réguler ou bloquer partiellement l’expression d’un gène altéré. Ces acides nucléiques sont le plus souvent transportés dans les cellules du patient grâce à un vecteur viral, mais ils peuvent également être injectés directement dans les cellules, sous forme d’ADN nu. PLAN 29

« Modification in vivo » 3. ADN: outil biotechnologique. Les protocoles de thérapie génique varient en fonction des indications et des objectifs thérapeutiques à atteindre. Cependant, ils consistent toujours à modifier génétiquement les cellules du patients, ex vivo ou in vivo, de façon pérenne ou transitoire. 3.2. Thérapie génique. 3.2.2. Méthode. « Modification in vivo » Cas du traitement de carcinomes de la tête et du cou. 3.2.2 On prépare le transgène. Il s’agit d’un gène suppresseur de tumeur (p53). Il est intégré dans un vecteur, un adénovirus, virus capable d’infecter les cellules humaines. Plus de 10 000 patients ont été traités par ce médicament à ce jour, sans effet indésirable notable.  PLAN 30

« Modification ex vivo » 3. ADN: outil biotechnologique. Les protocoles de thérapie génique varient en fonction des indications et des objectifs thérapeutiques à atteindre. Cependant, ils consistent toujours à modifier génétiquement les cellules du patients, ex vivo ou in vivo, de façon pérenne ou transitoire. 3.2. Thérapie génique. 3.2.2. Méthode. « Modification ex vivo » Cas d’une maladie monogénique qui affecte les cellules sanguines. 3.2.2 Des cellules souches hématopoïétiques (cellules à l’origine de l’ensemble des cellules sanguines) sont prélevées chez le patient lors d’une procédure qui s’apparente à une simple prise de sang.  Ces cellules sont ensuite modifiées ex vivo : un vecteur est utilisé pour leur délivrer un transgène thérapeutique Elles sont placées en culture pendant quelques jours Lorsque les cellules ainsi traitées commencent à exprimer le gène thérapeutique, elles sont finalement réinjectées au patient par perfusion veineuse. Les cellules modifiées vont alors proliférer dans l’organisme du patient et, à priori, contribuer à le soigner PLAN 31

3.2.2 3. ADN: outil biotechnologique. 3.2. Thérapie génique. 3.2.2. Méthode. Récapitulatif 3.2.2 PLAN 32

Choix des reproducteurs 3. ADN: outil biotechnologique. Un « organisme génétiquement modifié » est un organisme vivant (micro-organisme, végétal ou animal) dont le génome a été modifié artificiellement.  3.3. OGM. 3.3.1. Principe. Nombreuses méthodes 3.3.1 La sélection. Choix des reproducteurs Croisement entre sous-espèces L’hybridation. Implantation de nouveaux gènes Transgénie PLAN 33

3.3.3 3. ADN: outil biotechnologique. 3.3. OGM. 3.3.2. Intérêt. La manipulation génétique a pour but d’introduire de nouvelles caractéristiques Chez les cellules ou organismes modifiées. 3.3. OGM. 3.3.2. Intérêt. Résistance aux insectes Agronomie Résistance aux herbicides 3.3.3 Permet de revendre tous les ans les graines aux producteurs. Gène de stérilité Production d’insuline Ces protéines sont produites par des bactéries, des levures ou des cellules de mammifère en culture. Production facteur VIII (hémophilie Médecine Hormone de croissance Modification des marqueurs du soi pour une xénogreffe. Stade de recherche PLAN 34 Industrie Production de bioéthanol Carburant synthétisé par des algues

Disparition à moyen terme des souches sauvages ? 3. ADN: outil biotechnologique. 3.3. OGM. 3.3.2. Polèmique. Risques directs Apparition d’un facteur toxique ou cancérigène. Uniformisation des culture sous l’influence de l’industrie agro-alimentaire. biodiversité 3.3.2 Moins d’adaptabilité des cultures aux changements climatiques et à l’apparition de maladie. Utilisation massive des herbicides depuis l’introduction de gènes de résistance. On ne peut pas empêcher la dissémination des graines ou du pollen. Contamination Disparition à moyen terme des souches sauvages ? PLAN 35

4.1 4. Génétique des populations. La génétique des populations est l’étude de la distribution et de l'évolution au cours du temps des fréquences alléliques et génotypiques dans les populations.  4.1. Principe. On étudie la fréquence de certains allèles dans différentes populations. Une différence notable indique que ces population possèdent des origines différentes. 4.1 Il existe plusieurs types d’étude selon la nature des allèles étudiés. Comparaison classique sans spécificité autre que l’allèle étudié. Autosome Chromosome Y Lignée patriarcale (transmis de père en fils) Chromosome mitochondrial Lignée matriarcale (transmis de mère en fille) PLAN 36

Répartition des allèles des groupes sanguins. 4. Génétique des populations. Répartition des allèles des groupes sanguins. 4.1. Principe. 4.1 PLAN 37

4.2 4. Génétique des populations. 4.2. Filiation. Les gènes subissent des mutations à intervalle régulier. Un certain nombre de ces mutations sont conservées par une espèce donnée. 4.2 Si deux espèces se séparent sur l’arbre phylogénétique, elles auront tendance à subir des mutations différentes. Plus les différences sont nombreuses, plus le temps écoulé depuis la séparation est grand. Il est actuellement impossible d’étudier la totalité du génome. Il convient donc de choisir les génes les plus adaptés à l’étude. Il s’agit des marqueurs. PLAN 38