Compter les Microorganismes

Méthodes Mesure de turbidité Comptes viables Nombre le plus probable Comptes directs

Mesure de la Turbidité  Mesure la quantité de lumière qui peut traverser un échantillon Le moins de lumière qui traverse l’échantillon le plus dense est la population Mesure la densité optique ou le pourcentage de transmission

Mesure de la Turbidité Spectrophotomètre (A600): Mesure de la Densité Optique (D.O.) Lumière 600nm Détecteur….lecture Lecture différente

Mesure de la Turbidité Relation inverse 2.0 1.0 D.O. 600nm 2.0 1.0 D.O. 600nm % Transmission 100 50 Densité cellulaire Relation inverse

Comptes Viables Dilutions en séries de l’échantillon Étalement des dilutions sur milieu approprié Chaque colonie simple est originaire d’une unité formatrice de colonie (UFC) Le nombre de colonies est équivalent à une approximation du nombre de bactéries vivantes dans l’échantillon

Dilution en série 63 UFC/0.1 ml de 10-5 630 UFC/1.0 ml de 10-5 630 UFC/ml X 105 = 6.3 x 107/ml dans l’échantillon original S’il y avait 100 ml d’échantillon bactérien?

= = Comptes Viables Avantages: Limites: Dénombre les microorganismes viables Peu distinguer différents microorganismes Limites: Pas de milieu universel Ne peut pas demander combien de bactérie dans un lac Peut demander combien d’E. coli dans un lac Nécessite la croissance du microorganisme UFC une bactérie Ex. Un UFC de Streptococcus  un de E.coli = ? = ?

Comptes Directes L’échantillon à être énuméré est appliqué sur une lame d’hémacytomètre qui retient un volume fixe dans une chambre de comptage Le nombre de cellules est compté Le nombre de cellules dans le volume donné est déterminé

Utilisation d’un hémacytomètre

Utilisation d’un hémacytomètre (suite)

Utilisation d’un hémacytomètre (suite)

Déterminer le Compte Direct Compter le nombre de cellules dans trois carrés indépendants ayant les même dimensions 8, 8 et 5 Déterminer la moyenne (8 + 8 + 5)/3 =7 Donc 7 cellules/carré

Déterminer le Compte Direct (suite) 1mm Profondeur: 0.1mm 1mm Calculer le volume d’un carré: = 0.1cm X 0.1cm X 0.01cm= 1 X 10-4cm3 ou ml Diviser le nombre moyen de cellules par le volume d’un carré Donc 7/ 1 X 10-4 ml = 7 X 104 cellules/ml

Problème Un échantillon de 500μl est appliqué à une lame d’hémacytomètre avec les dimensions suivantes: 0.1mm X 0.1mm X 0.02mm. Des comptes de 6, 4 et 2 cellules ont été faits dans trois carrés indépendants. Quelle était le nombre de cellules par millilitre dans l’échantillon original si la chambre de comptage possède 100 carrés?

Nombre le Plus probable: NPP Fondé sur les statistiques de probabilités Test présomptif fondé sur des caractéristiques données Technique en bouillon

Nombre le Plus Probable (NPP) Commencer avec un bouillon qui permet de déceler les caractéristiques désirées Inoculer differentes dilutions de l’échantillon à être testé dans chacun de 3 tubes -1 -2 -3 -4 -5 -6 Dilution 3 Tubes/Dilution 1 ml de chaque dilution dans chaque tube Après une période d’incubation approprié, enregistrer les TUBES POSITIFS (qui ont de la croissance et les caractéristiques désirées)

NPP (Suite) L’objectif est de DILUÉ l’organisme à zero Après l’incubation, le nombre de tubes qui démontre les caractéristiques désirées sont enregistré Exemple de résultats pour une suspension de 1g/10 ml de terre Dilutions: -1 -2 -3 -4 Tubes positifs: 3 2 1 0 Choisir la bonne suite: 321 et la retrouver dans le tableau Multiplier le résultat par le facteur de dilution central 150 X 102 = 1.5 X 104/mL Puisque vous avez 1g dans 10mL doit multiplier encore par 10 1.5 X 105/g

La Microscopie Les Colorations

Colorations Simples Coloration positive Colorations négatives Coloration du spécimen Coloration indépendante de l’espèce Colorations négatives Coloration de l’environnement de fond

Méthode Coloration simple: Un seul agent de coloration Permet de déterminer la taille, la forme, et l’arrangement des cellules

Les Formes Cellulaires Coccus: Sphères Division sur 1,2 ou 3 plans Nombre de plans de division donne différents arrangements Arrangements typiques de différents genres bactériens

Les Cocci (Coccus) Plans de division Arrangements Diplococcus Streptococcus (4-20) Tétrade Staphylococcus Indice: si le nom du genre de bactéria finisse par coccus, la forme de la bactérie est cocci

Les Formes Cellulaires (suite) Bacilles: Bâtonnets Division sur 1 plan seulement Arrangements typiques de différents genres bactériens

Les Bacilles Plans de division Arrangements Diplobacille Streptobacille Eg. Clostridium = bacille Indice: si le nom du genre de bactérie finisse par bacille, la forme de la bactérie est bacille Si elle ne finisse pas par cocci, c’est probablement une bacille.

Colorations Différentielles Microscopie Colorations Différentielles

Coloration de Gram (coloration différentielle) Divise les bactéries en deux groupes Gram Négatives & Gram Positives

Gram Positives Colorées Mauves Bacille Coccus Genres: Bacillus et Clostridium Coccus Genres: Streptococcus, Staphylococcus et Micrococcus

Gram Négatives Colorées Rouges Bacille: Coccus: Genres: Escherichia, Salmonella, Proteus, etc. Coccus: Genres: Neisseria, Moraxella et Acinetobacter

Règles Si le nom est bacillus et/ou clostridium = Gram (+), bacille Si le nom finisse par coccus ou cocci (autre que les 3 exceptions, qui eux sont Gram (-)) = forme de coccus et Gram (+) Si ça fait pas partie des règles ci-dessus, = Gram (-) bacilles

Paroi Cellulaire Gram + Vs Gram - Paroi Peptidoglycane Membrane Couche de Lipopolysaccharide Absente Paroi Peptidoglycane Membrane Plasmique

Méthode - Coloration Primaire + Coloration avec le cristal violet Ajout d’iode de Gram (Mordant) + + Paroi :peptidoglycane LPS - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Membrane plasmique Gram positif Gram Négatif

Méthode - Étape Différentielle Lavage à alcool Paroi est déshydratée – Complex colorant + iode est piégé Paroi n’est pas déshydratée – Complex n’est pas piégé Paroi :peptidoglycane LPS - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Membrane plasmique + + Gram positif Gram Négatif

Méthode - Contre Coloration + Coloration avec la Safranine + + Paroi :peptidoglycane LPS - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Membrane plasmique + Gram positif Gram Négatif

Sommaire Gram Négatif Gram Positif Fixation Coloration primaire Violet de cristal Lavage Décoloration Contre coloration Safranine

Coloration Acido-Alcoolo-Résistante Coloration diagnostique de Mycobactérium Pathogènes de la Tuberculose et de la Lèpre Paroi cellulaire avec acide mycoïque Cireuse, très imperméable

Méthode Principe: Contenu élevé de composés similaires aux cires dans la paroi cellulaire, Acide Mycoïque, rend ces bactéries très résistantes aux colorants

Méthode (Suite) La paroi est rendue perméable par la chaleur Coloration avec de la fuchsine basique À base de phénol, soluble dans la couche mycoique Refroidissement retourne la paroi à son état imperméable Colorant est piégé Lavage avec de l’alcool acide Étape différentielle Mycobactéries retiennent le colorant Autres bactéries perdent le colorant

Coloration de Spores Spores: Cellule bactérienne différentiée Résistante à la chaleur, la déshydratation, les ultraviolets, et différents traitements chimiques Alors, très résistante aux colorant aussi! Typique des bacilles Gram positifs Genres Bacillus et Clostridium Conditions défavorables induisent la sporogénèse Différenciation de cellule végétative à l’endospore E.g. Anthrax

Coloration au Vert de Malachite Spores (structures résistantes utilisées pour la survie dans des conditions défavorables) Sporangium (strucutre dans laquelle les spores se forment) Endospore (dormant, non reproductrices) Cellules végétatives (en croissance active) Perméabilisation des spores par la chaleur Coloration primaire au vert de malachite Lavage Contre coloration à la safranine