Les éléments transposables : organisation génomique et impact évolutif Karine ALIX, AgroParisTech alix@moulon.inra.fr Master 1 BIP Evolution et Organisation du Génome

Plan suivi I. Introduction. Qu’est-ce que des séquences d’ADN répétées ? Place des éléments transposables II. Classification, mode de transposition et organisation génomique des éléments transposables III. Quand le génome domestique des éléments transposables IV. Rôle des éléments transposables dans les réponses aux stress V. Conclusion. Eléments transposables et plasticité du génome

I. Introduction qu’est-ce que des séquences d’ADN répétées ? Place des éléments transposables

Les séquences d’ADN répétées Dénaturation d’ADN génomique et renaturation progressive; mesure du taux d’ADN non renaturé au cours du temps, en fonction de la concentration initiale C0 Unicellulaires Une seule courbe bien lisse Comme trois courbes bout à bout

Les séquences d’ADN répétées Dénaturation d’ADN génomique et renaturation progressive; mesure du taux d’ADN non renaturé au cours du temps, en fonction de la concentration initiale C0 Unicellulaires Un seul type d’ADN et renaturation progressive et régulière Trois types d’ADN à taux de répétition différents

Les séquences d’ADN répétées ADN hautement répété /10 à 15% du génome Peu codant, hétérochromatique (fortement condensé) Séquences répétées en tandem = les satellites / centromériques, télomériques type TTTAGGG ADN moyennement répété /25 à 40% du génome Séquences répétées dispersées = les éléments transposables, avec un certain taux de diversité Les gènes des ARN ribosomiques ARNr, de transfert ARNt (>200 copies) ADN unique ou faiblement répété Séquences uniques ou à faible nombre de copies = la fraction codant des protéines

Les séquences d’ADN répétées correspondent aux éléments transposables (TTTAGGG)n Schmidt and Heslop-Harrison, TPS 1998

Eléments transposables : la découverte Dès 1940s : maïs / Barbara McClintock Altération de la pigmentation de grains de maïs ET inséré dans un gène de la chaîne de biosynthèse des anthocyanes  pas de pigmentation Expression du gène et pigmentation quand excision Taille des tâches en fonction du moment où a eu lieu l’excision 1902-1992 Pas de produit du gène ET gène actif Pigmentation ET

Eléments transposables : la découverte Modélisation avec deux éléments : Ds Dissociator Ac Activator Premières notions de l’existence d’éléments de contrôle de l’expression des gènes / prémices des mécanismes de la régulation génique Prix nobel en 1983 1902-1992 Système Ac/Ds Pas de produit du gène Ds gène actif Pigmentation Ac Ds

Eléments transposables : définition Caractéristiques : Fragment d’ADN mobile Capable de se déplacer de façon autonome dans le génome Terme « élément transposable » dans les années 70s / génétique moléculaire Constituant majeur du génome eucaryote Arabidopsis : 15% drosophile : 22% maïs : 80% homme : 45% blé : 90%

II. Classification, mode de transposition et organisation génomique des éléments transposables

Les différentes classes Casacuberta and Santiago, Gene 2003

Modèle « copier – coller »  rétrotransposons à LTR Particule de type viral Système réplicatif Sabot et al, Euphytica 2004

Les différentes classes Réplication par ‘copier–coller’ en passant par un ARN Casacuberta and Santiago, Gene 2003

Modèle « couper-coller » transposons sens strict MITEs transposase Système conservatif Sabot et al, Euphytica 2004

Les différentes classes Réplication par ‘copier–coller’ en passant par un ARN Réplication par ‘couper-coller’ en restant en ADN Casacuberta and Santiago, Gene 2003

Classification acceptée

Classification acceptée

Rétrovirus et rétrotransposons : une question d’évolution…

Les caractéristiques spécifiques des LTR Les LTR, long tandem repeats – séquences répétées en orientation directe - contiennent les régions promotrices et régulatrices des séquences codantes de l'élément et comportent trois domaines fonctionnels : U3, R et U5. Les séquences promotrices ne sont actives qu’au niveau du LTR en 5’ ; les sites de polyadénylation ne sont actifs qu’au niveau du LTR en 3’. La région R des LTR se retrouve aux deux extrémités du transcrit et est indispensable pour la transcription inverse de cet ARNm en ADNc. Les LTR sont tous subdivisés en trois régions, désignées par rapport à leur position sur l’ARNm : U3 (pour unique en 3’ de l’ARN), R (pour répétée aux deux extrémités de l’ARN) et U5 (pour unique en 5’ de l’ARN).

Exercice 1 p.4

Les transposons bactériens : IS et Tn M.C. Serre Les transposons bactériens : IS et Tn Les séquences d’insertion IS sont des ET de petite taille (de 750 à 2500 pb) présentant une organisation très compacte, universellement retrouvés dans le phylum procaryote. IR = répétitions inversées (inverted repeats) gène codant la transposase Coopération possible entre IS. Cela permet de transposer tout fragment d’ADN compris entre deux copies d’IS identiques ; on parle de transposon composite.

Les transposons bactériens : IS et Tn M.C. Serre Les transposons bactériens : IS et Tn Association de gènes de résistance à des antibiotiques Chloramphénicol / tétracycline Les transposons unitaires sont plus homogènes et possèdent 2 gènes : une résolvase (assurant une étape de recombinaison au site res) en plus d’une transposase.

Les transposons bactériens : IS et Tn M.C. Serre Les transposons bactériens : IS et Tn Les transposons conjugatifs forment une famille très homogène. Le plus petit de ces éléments, Tn916, a une taille de 18,4 kpb, ce qui classe cette famille dans les très grands ET, les plus importants pouvant atteindre 100 kpb. De 18 à 100 kpb Leurs extrémités sont formées de séquences inversées répétées de 20 à 30 pb. Entre ces bornes on trouve des gènes impliqués dans la coupure et l’échange de brins d’ADN, la conjugaison, et des marqueurs de résistance (antibiotiques par exemple).

Chr d’E.coli (5 copies), facteur F (1 copie), nbx plasmides Exemples de séquences d’insertion IS : Séquence IS Occurence longueur bp IR bp* Séquence cible bp IS1 Chromosome d’E. coli (5 à 8 copies) de Salmonella (40 copies), nbx plasmides, phage P1, Tn951 768 18/23 9 IS2 Chr d’E.coli (5 copies), facteur F (1 copie), nbx plasmides 1327 32/41 5 IS50 constituant de Tn5 1534 8/9 IS101 plasmide pSC101 de E. coli 1209 30/36 * le 1er nombre représente le degré de perfection du palindrome, le 2ème sa longueur.

Les éléments transposables sont en partie responsables de la diversité structurale des génomes, voire de leur expression

Les différences de taille du génome pin – 23 000 Mpb Arabidopsis 125 Mpb betterave 750 Mpb Or contenu génique équivalent… Enrichissement différent en éléments transposables Schmidt and Heslop-Harrison, TPS 1998

Un exemple : Les Helitrons et la variabilité génomique du maïs Lai et al. 2005 PNAS 102: 9068-9073.

Haplotype variability in maize Comparison of different locus between two inbred lines : Locus bz : McC // B73 Locus z1C : B73 // BSSS53 3 other genomic regions : B73 // Mo17 What is observed : Differences in TE content Not the same catalog of genes many unshared genes are truncated = pseudogenes Violation of genetic colinearity within the species Hypothetical origins = INSERTIONS HOW?

Helitron : the discovery Discovered computationally : Arabidopsis rice Caenorhabditis Rolling-circle replication (≠ cut-and-paste) DNA helicase (replication) Nuclease/ligase (insertion) New type of DNA transposon Kapitonov and Jurka 2001 PNAS 98: 8714-8719

Helitron : main features Insertion between A and T of the host genome Ends = 5’TC and CTRR3’ (R = A or G) Palindromic sequences -> hairpins near the 3’ terminus No terminal inverted repeats (TIRs) No target site duplications (TSDs)

Analysis of the bz locus Inbred lines McC and B73 / 150 kb TE content completely different 4 genes are entirely missing from B73 Fu and Dooner 2002 PNAS 99: 9573-9578

Sequences are 99% identical! McC Blast GSS B73 Sequences are 99% identical! Analysis of a BAC sequence from B73

9S McC Blast GSS B73 5S Analysis of a BAC sequence from B73

Insertion polymorphism in the bz locus 2 independent insertions AT DELETION AT AT AT Sequences flanking the insertion/AT dinucleotide are identical!

The two Helitrons carry only gene fragments = pseudogenes! McC Blast GSS B73 cDNA from B73 but pseudogene exons from different genes No other cDNA found The two Helitrons carry only gene fragments = pseudogenes!

Evolution of the maize genome Helitrons and insertion / recent phenomenon ≠ Evolution of maize genome from tetraploidy to diploidy with many deletions and gene loss Helitrons mediate gene movement among maize lines, a general mechanism 20% of 21 000 genes differ in genome location between B73 and Mo17 because of helitron activity Morgante et al. 2005 Nat Genet 37: 997-1002.

From a functional point of view… Some helitrons carrying gene fragments are expressed / transcription of an RNA  Function can be affected: RNA interference Translation in a new protein Helitrons contribute to the haplotype variability of maize differences in gene expression between lines Buckler et al. 2006 Curr Op Plant Biology

Quand le génome domestique les éléments transposables III. Quand le génome domestique les éléments transposables

De l’ADN poubelle à l’ADN domestiqué « L’accumulation des ET, qui peut être très importante dans certains génomes, suggère que de nombreuses insertions d’ET peuvent être neutres et constitue un des arguments en faveur de l’hypothèse de l’ADN « poubelle » (= junk DNA) pour expliquer l’abondance de l’ADN non-codant chez les eucaryotes (KIDWELL & LISCH 2000). De nombreuses insertions d’ETs sont éliminées par sélection car elles induisent des effets délétères. » Et parfois, des insertions sont avantageuses et ont été sélectionnées : on parle de domestication des ET.

Les télomères chez la Drosophile HeT-A, TART, et TAHRE, qui seraient d’anciens rétrotransposons, jouent le rôle de télomères chez D. melanogaster Maintien de l’intégrité des télomères vital pour réplication cellulaire Intégrité du génome Quelques dizaines de kb ou plus de séquences dites télomériques aux extrémités des chromosomes /TTAGGG chez l’Homme ; TTTAGGG chez Arabidopsis + activité d’une télomérase absente chez Drosophila D’anciens rétrotransposons sans LTR = LINEs auraient été domestiqués pour constituer les extrémités protectrices des chromosomes chez D. melanogaster (génome séquencé) N’ont jamais été trouvés ailleurs dans le génome ! Pardue and DeBaryshe PNAS, 2011

Le système immunitaire des mammifères Les protéines RAG1 et RAG2 seraient d’anciens ETs « domestiqués » pour la formation des gènes d’anticorps, par recombinaison Recombinase VDJ impliquée dans la fabrication des récepteurs des cellules T de l’immunité diversité de ces récepteurs (ciblés contre la diversité des antigènes) liée à la recombinaison somatique, impliquant des cassures dans l’ADN Deux sous-unités de cette recombinase = RAG1, RAG2, responsables des clivages de l’ADN, avec mécanisme identique à une transposase Origine : capture par transfert horizontal d’un ancien transposon à ADN avec TIRs, de la superfamille des Transib, il y a 500 millions d’années (Kapitonov & Koonin, 2015)

La mise en place du placenta chez les mammifères Rétrovirus et transposons à l’origine de la mise en place et de la diversification du placenta chez les mammifères Le placenta peut-être défini comme le tissu à l’interface des tissus maternels et fœtaux Organe le plus diversifié (forme, type cellulaire,…) chez les mammifères A l’origine : une infection par un rétrovirus aurait abouti à son intégration dans le génome et au recrutement de ses régulateurs d’expression génique /mise en place du premier placenta Etapes d’évolution ultérieure : MER20, un transposon de classe II, est à l’origine de la régulation de l’expression des gènes localisés dans la paroi utérine /reprogrammation fonctionnelle spécifique au niveau du placenta

Le déterminisme sexuel du melon L’insertion d’un transposon est responsable de la transition de fleurs mâles à fleurs femelles chez le melon PI 124112 Gynadou × Identification du locus G et de la forme g, impliqué dans la transition fleur mâle -> fleur femelle

Le déterminisme sexuel du melon Gynadou AAgg x AAGG PI 124112 1,4 kb pour le locus G de PI 124112 1,4 kb + insertion transposon hAT pour le locus g de Gynadou + Corrélation locus g et présence du transposon _

Le déterminisme sexuel du melon Gynadou AAgg x AAGG PI 124112 1,4 kb pour le locus G de PI 124112 1,4 kb + insertion transposon hAT pour le locus g de Gynadou Inhibition de l’expression par méthylation ORF3 encodes a C2H2 zinc-finger transcription factor of the WIP protein subfamily16. In Arabidopsis thaliana, two members of this plant-specific protein family, TT1 and NTT, have been described, and shown to be involved in the development of female structures in the carpel16,17. On the basis of this homology, we renamed ORF3 C. melo WIP1 (CmWIP1). + Corrélation locus g et présence du transposon _ Mécanisme : Il s’agit d’un contrôle épigénétique de l’expression de l’ORF3 causé par le transposon; quand il y a insertion du transposon, il y a méthylation et non expression de l’ORF3.

Rôle des éléments transposables dans les réponses aux stress IV. Rôle des éléments transposables dans les réponses aux stress

Condensation de la chromatine Degré de condensation de la chromatine / modifications chimiques des histones et de l’ADN = acétylation – phosphorylation – ubiquitinylation - méthylation

Impact du degré de méthylation Si modification chimique des histones et de l’ADN par méthylation : Modification du degré de condensation de la chromatine Modification de l’activité transcriptionnelle des gènes présents Modification épigénétique ! Modification héritable au niveau de l’expression du génome sans changement de la séquence nucléotidique de l’ADN

Une hétérochromatine méthylée méthylation = pas ou peu de transcription ! La méthylation est nécessaire à la stabilité du génome Analyse de mutants où absence de méthylation Souris : mort Végétaux : phénotypes très perturbés ex : mutant ddm1 chez Arabidopsis decreased DNA methylation 1, ddm1 Miura et al, Nature 2001

Une hétérochromatine méthylée Mutant ddm1 d’Arabidopsis thaliana / absence de méthylation Forte activité des éléments transposables ! Transposition d’un transposon de classe II, type CACTA (Miura et al, Nature 2001) De même pour transposon de type Mutator (Singer et al, Genes Dev 2001) Maïs et transposition du transposon Spm quand déméthylation du promoteur (Fedoroff et al, BioEssays 1995)

Une hétérochromatine méthylée Le silencing des éléments transposables, une question de survie pour l’espèce hôte ! Les éléments transposables sont source de mutations Recombinaison illégitime entre éléments dispersés / aberrations chromosomiques, génomiques Transposition possible dans des gènes vitaux / knock-out de gène vitaux Accumulation des éléments transposables dans les régions hyper-condensées et hyper-méthylées de l’hétérochromatine

L’hétérochromatine Lieu d’accumulation des éléments transposables Majoritairement constituée de séquences d’ADN répétées non codantes Caractéristiques : Compaction importante ADN fortement méthylé Faible activité transcriptionnelle Par opposition à l’euchromatine, qui contient l’ensemble des gènes Centromères / Télomères / Certains chromosomes Voir cours de Caroline Hartmann

Réponse du génome au stress état normal éléments transposables non actifs « silencés » par hétérochromatinisation = condensation et méthylation de l’ADN Stress ? changements dans le degré de méthylation de l’ADN état stressé déméthylation et décondensation de l’ADN  transcription possible ! éléments transposables actifs

Question : Tnt1 peut-il être activé par l’attaque d’un pathogène ? Attaque de pathogènes Rétrotransposon de type copia Tnt1 / les Solanacées 5,3 kb 500-600 copies Question : Tnt1 peut-il être activé par l’attaque d’un pathogène ? Activation d’un rétrotransposon Vérifier si le rétrotransposon est transcrit Est-elle accompagnée de transposition ?

Attaque de pathogènes Suivi de l’expression du promoteur de Tnt1A blessure Suivi de l’expression du promoteur de Tnt1A Construction LTR-GUS Transformation de plants de tomates Blessure à la lame de rasoir. Expression du gène Gus, le long des entailles faites avec la lame de rasoir : forte coloration bleu foncé. A droite, témoin CaMV35S (promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou) + Gus / on voit bien les entailles peu de bleu donc peu d’expression. Activation du promoteur contenu dans le LTR de Tnt1A par la blessure. ___________ Injection à l’aiguille d’un champignon infectieux qui dégrade les parois cellulaires par action d’une cellulase fongique, et expression de la construction LTR-GUS dans la région de la feuille où a diffusé l’extrait fongique / tâche bleue bien régionalisée. Gène reporter Gus sous contrôle du promoteur LTR inoculation Grandbastien, Trends in Plant Sci 1998

Attaque de pathogènes Recherche de nouvelles insertions de Tnt1A après application d’extraits fongiques Plants de tabac régénérés à partir de protoplastes et d’explants (témoins) Technique S-SAP (Sequence -Specific Amplification Polymorphism) http://www-ijpb.versailles.inra.fr/fr/bc/equipes/Transposons/

Attaque de pathogènes De nouvelles bandes S-SAP « apparaissent » 25 % des plantes régénérées à partir de protoplastes 2,7 % des plantes régénérées à partir d’explants - témoins extraits fongiques / attaque de la paroi cellulosique méthode de régénération / culture tissulaire Melayah et al, Plant J 2001

Attaque de pathogènes Conclusions Activité transcriptionnelle de Tnt1A Suivie de transposition En réponse à une blessure une inoculation par un champignon l’application d’extraits fongiques L’attaque de pathogènes induit l’activation de Tnt1A

Attaque de pathogènes région U3 : des analogies avec les régions régulatrices des gènes de défense Polymorphisme de la région U3 = spécificité de réponse au stress Casacuberta and Santiago, Gene 2003

Attaque de pathogènes D’autres cas répertoriés : Tto5 (tabac) – virus de la mosaïque du tabac Bs1 (maïs) – virus de la mosaïque de l’orge Implication des éléments transposables dans les mécanismes de défense des végétaux

Exercice 2 p.7 à 9

Eléments transposables et plasticité du génome V. Conclusion Eléments transposables et plasticité du génome

Des éléments ubiquitaires et généralement réprimés Les éléments transposables se retrouvent chez tous les organismes vivants Les éléments transposables sont des éléments à fort pouvoir mutagène Ils sont parfois en très grand nombre de copies dans le génome Ils sont maintenus dans le génome MAIS soumis à une répression de leur activité transcriptionnelle

Une valeur adaptative certaine Les éléments transposables sont source de variabilité génétique Et présentent une importante valeur adaptative Mécanismes de défense aux stress biotiques Mécanimes d’adaptation aux stress abiotiques Des mutations peuvent être bénéfiques et sélectionnées par le génome hôte

La plasticité du génome Génome statique, figé Génome plastique, dynamique - Structure - Fonction Impact important des éléments transposables sur la diversité génomique Importance des mécanismes épigénétiques – méthylation, ARN interférence,… / domaine en pleine investigation

La course au séquençage du génome des espèces d’intérêt (ici végétales) Possible par l’innovation technologique et le développement des approches NGS cours de Bénédicte Sturbois MAIS, comment atteindre la fraction correspondant à l’ensemble des éléments transposables ? Problème dans l’assemblage de la séquence au niveau de ces régions répétées. Il ne nous reste qu’à continuer à fouiller dans la « poubelle » des sorties des séquenceurs… Vitte et al. 2014

Merci

Diapos supplémentaires

Mary-Lou Pardue, and P. G. DeBaryshe PNAS 2011;108:20317-20324 Rétrotransposons Télomériques de D. melanogaster et D. Virilis (>40 millions d’années depuis leur séparation) Telomeric retrotransposons from D. melanogaster and D. virilis (approximately to scale). Magenta, 5′ and 3′ UTRs of HeT-A and TAHRE; blue, 5′ and 3′ UTRs of TART; white, Gag and Pol ORFs; gold arrows in 5′ and 3′ UTRs of TARTmel elements (see Figs. 3B and 4 and accompanying text), PNTRs; (A)n, 3′ oligoA; bent arrows, transcription start sites for full-length sense-strand RNA (note that, for HeT-Amel and TARTvir, the element transcribed is immediately downstream of the element shown); asterisks above TART elements, start site for short sense-strand RNA; asterisks below TARTs, start site for nearly full-length antisense RNA (not determined for TART-C). The length of 5′ UTRs in TARTmel elements is extremely variable. Those lengths shown here representing the three subfamilies were the first to be sequenced; other members of these subfamilies have shorter or longer 5′ UTRs. 5′ PNTR extends to the 5′ end of the element; thus, the length of any element’s 3′ PNTR is defined by the length of its 5′ PNTR. Although the TARTvir 3′ UTR is much shorter than the 3′ UTR of the other elements, it is more than two times the length of the 3′ UTR of nontelomeric jockey clade elements that we have analyzed. TARTvir Pol ORF also has a 3′ extension of ∼1.2 kb, with no obvious motifs to indicate its function (14). This sequence is not seen in the other elements and might do double duty as 3′ UTR when the element forms telomere DNA. Elements shown are HeT-Amel, U06920, nucleotides 1,015–7,097; HeT-Avir, AY369259, nucleotides 7,211–13,612; TARTmel -A, AY561850; TARTmel -B, U14101; TARTmel -C, AY600955; TARTvir, AY219709, nucleotides 4,665–13,208; and TAHRE, AJ542581. Mary-Lou Pardue, and P. G. DeBaryshe PNAS 2011;108:20317-20324 ©2011 by National Academy of Sciences

Modèle du déterminisme sexuel chez le melon GG aa gg AA gg aa Idem si AA car action inhibitrice de GG sur l’expression du locus A