L’azacytidine comme traitement de la maladie du greffon contre l’hôte de type chronique sclérodermique expérimentale. Gilles Fransolet Gregory Ehx, Joan Somja, Loïc Delens, Muriel Hannon, Sophie Dubois, Pierre Drion, Jo Caers, Stéphanie Humblet-Baron, Ludovic Belle, Philippe Delvenne, Yves Beguin, Giuseppina Conteduca and Frédéric Baron. Laboratoire d’Hématologie, GIGA-Research, Université de Liège, Liège, Belgique.

Physiopathologie de la GVHD chronique Blazar B et al., Nature Review Immunology, 2012 Rôle prédominant des lymphocytes CD4 (et subsets) ; Rôle pivot des lymphocytes T régulateurs ; Physiopathologie complexe et incomplètement élucidée.

Modèle murin de GVHD chronique Jaffee BD et al., Cell Immunol, 1983. Chu YW et al., BBMT, 2008 Zhang C et al., Blood, 2006 Avantage : Modèle spécifique de la fibrose Inconvénients : Limité dans le temps Symptomatologie réduite

Schéma expérimental 5 groupes : Contrôle Azacytidine (Aza) 0,5 mg/kg Décitabine (Dac) 0,75 mg/kg Syngénique 10.106 CSH + 70.106 splenocytes issu de souris B10.D2 Irradiation corporelle totale à 7 Gy J10-J30 : Injection S.C. d’Aza/Dac J52 : sacrifice Balb/cJ Jours 7 10 21 30 35 49 52 Analyses FACS sur le sang

Azacytidine (Vidaza) Inhibiteur de la DNA méthyltransférase  hypométhylation de nombreux gènes ; Utilisé comme traitement des syndrômes myélodysplasique et des leucémies myéloïdes aigues. Hypométhylation du gène FoxP3  Conversion des Tconv en Treg. Effets cytostatiques et myélotoxiques. Issa JP et al., Nature Review Drug Discovery, 2005.

Score de sévérité Critères (0 – 1 – 2) : posture, perte de poids, fibrose, activité, perte de poils. * 0,05 < p < 0,01 ** 0,01 < p < 0,001 *** 0,001 > p

Statut physique des souris Jour 29 Contrôle Aza 0,5 mg/kg Aza 2 mg/kg Jour 45 Contrôle Aza 0,5 mg/kg Aza 2 mg/kg

Composants hématologiques sanguins Contrôle (n = 15) Aza 0,5 mg/kg (n = 14) Aza 2 mg/kg (n = 17) Syngénique (n = 2)

Analyses FACS : Sang J7-J49 Contrôle (n = 16) Aza 2 mg/kg (n = 16) Aza 0,5 mg/kg (n = 16) Syngénique (n = 2)

Analyses FACS : Sang J7-J49 Contrôle (n = 16) Aza 0,5 mg/kg (n = 16) Aza 2 mg/kg (n = 16) Syngénique (n = 2)

Score de sévérité Injection tous les 4 jours entre J10 et J30 après greffe

Statut physique des souris Jour 29 Control Aza 0,5 mg/kg Aza 2 mg/kg Jour 45 Control Aza 0,5 mg/kg Aza 2 mg/kg

Score de sévérité Injection d’Aza ou Dac tous les 2 jours entre J10 et J30 après greffe * 0,05 < p < 0,01 ** 0,01 < p < 0,001

Analyses FACS : Sang J7-J52 Contrôle (n = 8) Aza 2 mg/kg (n = 8) Dac 0,75 mg/kg (n = 5)

Analyses FACS : Rate J52 * 0,05 < p < 0,01

Quantification de la fibrose cutanée Contrôle Dac 0,75 mg/kg Aza 2 mg/kg

Quantification de la fibrose pulmonaire Contrôle Dac 1 mg/kg Aza 2 mg/kg

Statut de méthylation de l’enhancer FoxP3 Hpall : Reconnaît les séquences CCGG et ne peut couper en cas de méthylation. Mspl : Reconnaît les mêmes séquences CCGG et coupe même en cas de méthylation. Lal G et al., Epigenetics regulation of FoxP3 expression in Treg cells by DNA methylation, J Immunol, 2009.

Analyse du répertoire Vβ du TCR

Activité métabolique et production de collagène in vitro

Conclusion Résultats prometteurs : Augmentation de la proportion de Treg circulants, de leur prolifération après traitement et de leur expression du CD103 essentielle pour leur activité régulatrice. Diminution du score de sévérité de GVHD atteint par les souris traitées. Diminution de la fibrose cutanée. Diminution de la méthylation de l’enhancer du gêne FoxP3. Maintien de la diversité du répertoire Vβ du TCR. Effets cytostatiques levés dès l’arrêt du traitement. L’ensemble de ces effets tendent à démontrer l’efficacité de l’Azacytidine comme agent préventif dans l’apparition et la sévérité de la GVHD chronique sclérodermique.

Pr. Yves Beguin L’équipe du laboratoire d’Hématologie Unité d’expérimentation animale Pr. Pierre Drion Laboratoire d’auto-immunité génétique Dr. Stéphanie Humblet-Baron Pr. Frédéric Baron Service d’anatomo-pathologie Pr. Philippe Delvenne Dr. Joan Somja Plateforme d’immuno-histologie Dr. Chantal Humblet Estelle Dortu. Plateforme de cytotmétrie Dr. Sandra Ormenese Raafat Stephan