Laboratoire #3

Aujourd’hui dans le laboratoire Courbe de croissance bactérienne Analyse des résultats du NPP Fermentation par la levure Formation de biofilms Coloration de Gram

Croissance bactérienne

Croissance Bactérienne Augmentation du nombre de cellules La bactérie se reproduit par fission binaire (12, 24….2n) Les mesures de la croissance représentent des suivis des changements dans le nombre total de cellules ou de la masse des cellules

Fission Binaire Reproduction asexuée Réplication d’ADN  élongation cellulaire formation du septum septum complété et formation de la paroi séparation cellulaire et formation de cellules filles La quantité de toutes les molécules double : protéines, ADN, ARN, lipides pour les membranes, matériaux de la paroi, etc. Tout est distribué de façon quasi égale

Un doublement ADN Réplication ADN Élongation cellulaire Formation du septum Un doublement Formation du septum complété et synthèse de la paroi Séparation des cellules

Paramètres de Croissance Génération: 1 cellule → 2 cellules La population double Temps de génération (g): Le temps requis pour une division cellulaire g = temps/n (n: nombre de générations) Taux de croissance (µ): Changement du nombre de cellules ou de la masse cellulaire/temps

Croissance en Culture Discontinue (Batch) Système FERMÉ Aucun ajout de nouveaux nutriments Pas d’élimination des déchets Les cellules ne sont pas retirées Ex. Production de yogourt, fermentation de la bière, infection sanguine La densité cellulaire augmente jusqu’à ce que quelque chose devienne limitant

Profil de Croissance en Culture Discontinue Latence Exponentielle Stationnaire Mortalité Temps Inoculation (Temps = 0) Log10 du nombre de cellules

Phase de Latence ou d’Adaptation Aucune augmentation dans le nombre ou la masse de cellules Synthèses de composantes requises pour la croissance dans un milieu donné Adaptation métabolique

Phase Exponentielle  Développement et division cellulaire à vitesse maximale Le nombre et la masse cellulaire doublent à des intervalles réguliers Population en équilibre physiologique et biochimique La division se fait à un taux exponentiel

Division Exponentielle 1er doublement 2e doublement 3e doublement 4e doublement Nb final de cellules (N) = nombre initial de cellules (N0) X (2n) n = nombre de doublements

Division Exponentielle Temps (h) Nombre de générations (n) Nombre de cellules (N) Temps (h) 1 (20) 4.5 9 512 (29) 0.5 1 2 (21) 5 10 1024 (210) 2 4 (22) 5.5 11 2048 (211) 1.5 3 8 (23) 6 12 4096 (212) 4 16 (24) 6.5 13 8192 (213) 2.5 32 (25) 7 14 16384 (214) 64 (26) 7.5 15 32768 (215) 3.5 128 (27) 8 16 65536 (216) 256 (28) 8.5 17 131072 (217)

Tracer la Croissance Bactérienne

Calculs de Croissance Si vous commencez avec 1 cellule, combien en aurez-vous après 4 générations? No= Nombre initial de cellules N = Nombre de cellules après n générations n = nombre de générations Formule : N= No(2n) N = 1 (24) = 16 cellules Combien en auriez-vous si vous commenciez avec 100 cellules? Combien en auriez-vous si vous commenciez avec 100 cellules pour 5 générations?

Calculs de Croissance E. coli a un temps de génération de 20 minutes. Si vous commencez avec 1 cellule d’E. coli combien en aurez-vous après 2 heures? g=temps de génération et t=temps Formule: n=t/g n=(2 heures x 60minutes/heure)/20 minutes= 6 N= No(2n) N=1(26)=64 cellules Après 5 heures?

Calcul du Temps de Génération Vous commencez avec 2 cellules et finissez avec 2,000 cellules après 2 h. Combien de générations se sont écoulées? Quel est le temps de génération? Formule : n=3.3(logN-logNo) Donc n=3.3(log (2000)– log (2)) = 9.9 générations Formule : g=t/n g=120 minutes/9.9 générations = 12.12 minutes/g

Le Taux de Croissance - µ La croissance en fonction du temps: Plus le temps de génération est court, plus la croissance est rapide Plus la croissance est rapide, plus la pente est abrupte g=6 heures; pente 0.05 g=2 heures; pente 0.15 Pente: 0.05 Cellules/ml Population double en 6h Pente: 0.15 Cellules/ml Population double en 2h Temps (h)

Calcul de µ Après 4 h de croissance une culture d’E.coli passe de 100 cellules à 6.6 X 106 cellules Quel est le taux de croissance sous ces conditions? Formule: µ = ( (log10 N - log10 N0) 2.303) / (t - t0) Donc µ = (log 6.6 X 106 – log 100) 2.303/ 4 = 2.8 cell./h Quel est le temps de génération? Formule: µ = ln2/g ou g = ln2/µ Donc g = 0.69/2.8 = 0.25h ou 15 minutes

Constante du Taux de Croissance (K) K= Nombre de générations par unité de temps durant la croissance exponentielle Unité de temps: h-1 K= n/t n = nombre de générations t = nombre d’heures

Phase Stationnaire Arrêt de la croissance cellulaire Population n’est plus en équilibre Arrêt en raison d’un manque de nutriments, d’oxygène ou à une accumulation excessive de déchets, etc. Représente le rendement de croissance maximal sous les conditions données Yg : Masse de microorganismes formés/Masse (g) de substrat consommé Ym: Masse de microorganismes formés/mole de substrat consommé

Phase de Mortalité  Perte de viabilité exponentielle en raison d’un manque de nutriments ou d’une exposition prolongée à des déchets Pas nécessairement une perte de masse

Biofilms

C’est quoi les Biofilms? En nature plus de 90% des toutes les bactéries vivent dans des biofilms Les biofilms sont des collections de microorganismes qui se forment sur des surfaces solides Ex. La plaque dentaire et plaque et la pellicule visqueuse qui se forme sur les surfaces dans les zones aquatiques

Problèmes Causés par les Biofilms Ont tendance à boucher les tuyaux et les filtres à eau Peut causer de nombreuses maladies, y compris de nombreuses maladies communes dans les hôpitaux Très résistants aux antibiotiques Peut se former presque partout où il y a de l'eau, y compris des cathéters, des comptoirs de cuisine, etc.

Formation des Biofilms Se forme dans des endroits qui ont accès à l'eau Se fixe aux surfaces solides par plusieurs moyens: Fimbriae Parois cellulaires hydrophobes Polymères collants

Altruisme Parmi les Microorganismes Les biofilms sont comme de petites villes Avoir beaucoup de voisins très proches qui restent ensemble pendant de longues périodes de temps Les biofilms encouragent l'altruisme Les bactéries sacrifient leur taux de croissance maximum afin d’utiliser les ressources communautaires plus efficacement Bien que les individus sont désavantagés, la communauté dans son ensemble bénéficie

Fermentation par la Levure

Fermentation en Société Le procédé de la fermentation est essentiel pour… Production de carburant d'éthanol Fabrication du pain (la levure fait lever le pain) Boissons alcoolisées

Pourquoi la Fermentation? Fermentation: Métabolisme énergétique cellulaire fait en absence d’oxygène (anaérobie) Les levures sont souvent utilisées comme fermenteurs Elles consomment des sucres pour la libération d'énergie et des sous-produits tels que l'éthanol et du dioxyde de carbone La fermentation industrielle est le procédé par lequel l'éthanol est créé à partir de matières végétales renouvelables

Composantes de la Fermentation La fermentation comporte ... Substrats - habituellement un sucre Produit - la substance créée (éthanol) La fermentation nécessite un organisme qui peut utiliser des substrats en absence d'oxygène La levure (Saccharomyces) est souvent l'organisme de choix

Convertir le Glucose en Éthanol Glycolyse: Plus commun des sentiers glycolytiques Oxydation partielle du glucose au pyruvate Production nette de 2 ATP 2 NAD sont réduits au NADH Chacune de ces étapes procède deux fois pour chaque molécule de glucose

Fermentation - Éthanolique Capteur d’électron organique - Acétaldéhyde Régénération de NAD +