TD-1 régulation de l’expression génique Caroline Hartmann & Sophie Filleur

Etude des complexes protéiques associés aux histones des nucléosomes C. Hartmann & S. Filleur

PRC (Polycomb Repressive Complex) et leur activité modifiant les histones du nucléosome +Protéines CBX RING1A et RING1B= ubiquitin E3 ligases Complexe à activité méthyl-transférase Blackledge et al, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2015 C. Hartmann & S. Filleur

Deux modèles d’interaction des deux PRCs avec la chromatine Blackledge et al, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2015 Est-ce que le recrutement de PRC1 requiert PRC2 ou H3K27me3? C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que les protéines du complexe PRC1 sont capables d’interagir avec les histones H3 du nucléosome? Question 1: - Quels outils pouvez-vous utiliser pour observer l’interaction entre deux protéines? C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que les protéines du complexe PRC1 sont capables d’interagir avec les histones H3 du nucléosome? Question 1: - Quels outils pouvez-vous utiliser pour observer l’interaction entre deux protéines? - In silico C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que les protéines du complexe PRC1 sont capables d’interagir avec les histones H3 du nucléosome? Question 1: - Quels outils pouvez-vous utiliser pour observer l’interaction entre deux protéines? - In silico - In vitro C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que les protéines du complexe PRC1 sont capables d’interagir avec les histones H3 du nucléosome? Question 1: - Quels outils pouvez-vous utiliser pour observer l’interaction entre deux protéines? - In silico - In vitro Co-immunoprécipitation TAP-tag (Tandem Affinity Purification) C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que les protéines du complexe PRC1 sont capables d’interagir avec les histones H3 du nucléosome? Question 1: - Quels outils pouvez-vous utiliser pour observer l’interaction entre deux protéines? - In silico - In vitro Co-immunoprécipitation TAP-tag (Tandem Affinity Purification) -In vivo C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que les protéines du complexe PRC1 sont capables d’interagir avec les histones H3 du nucléosome? Question 1: - Quels outils pouvez-vous utiliser pour observer l’interaction entre deux protéines? - In silico - In vitro Co-immunoprécipitation TAP-tag (Tandem Affinity Purification) -In vivo Double-hybride en levure FRET BiFC C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que les protéines du complexe PRC1 sont capables d’interagir avec les histones H3 du nucléosome? Question 2: - Quelles conclusions pouvez-vous tirer de ces résultats? ES=Cellules de souche embryonnaire de souris C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que les protéines du complexe PRC1 sont capables d’interagir avec les histones H3 du nucléosome? Question 2: - Quelles conclusions pouvez-vous tirer de ces résultats? CBX2 du PRC1 est capable d’interagir avec H3 du nucleosome dans les cellules ES ES=Cellules de souche embryonnaire de souris Couleur rouge: Coloration de la chromatine par du Hoechst C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que les protéines du complexe PRC1 sont capables d’interagir avec les histones H3 du nucléosome? Quantification des interactions par cytomètre de flux C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que les protéines du complexe PRC1 sont capables d’interagir avec les histones H3 du nucléosome? Quantification des interactions par cytomètre de flux Question 3: - Quelles conclusions pouvez-vous tirer de ce résultat? Corrected fluorescence= signal comparé au signal constitutif CFP et aux quantités de protéines CBX et H3 (western blot) EED: souche incapable de méthyler H3 en K27 C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que les protéines du complexe PRC1 sont capables d’interagir avec les histones H3 du nucléosome? Quantification des interactions par cytomètre de flux Question 3: - Quelles conclusions pouvez-vous tirer de ce résultat? La méthylation de H3K27 n’affecte pas l’interaction entre CBX2 et H3 dans les cellules ES (pas de différence significative) Corrected fluorescence= signal comparé au signal constitutif CFP et aux quantités de protéines CBX et H3 (western blot) EED: souche incapable de méthyler H3 en K27 C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que l’interaction entre la protéine CBX2 du complexe PRC1 et l’histone H3 affecte la méthylation H3K27? Question 4: - Quelle stratégie pourriez-vous envisager pour tester l’effet de l’interaction CBX2-H3 sur H3K27me3? C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que l’interaction entre la protéine CBX2 du complexe PRC1 et l’histone H3 affecte la méthylation H3K27? Anticorps anti-CBX2 ou anti-FLAG (tag fusionné à CBX2) Protocole co-immunoprécipitation: Utilisation d’un anticorps anti-H3 Lee et al, Nature Protocols, 2013 C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que l’interaction entre la protéine CBX2 du complexe PRC1 et l’histone H3 affecte la méthylation H3K27? Reconnaît les protéines exogènes fusions CBX-YN et H3-YC Reconnaît la protéine endogène H3 et la protéine exogène H3-YC Immnuprécipitation (IP) avec anti-Flag (Tag fusionné à CBX2) In=surnageant Etoile: Ac C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que l’interaction entre la protéine CBX2 du complexe PRC1 et l’histone H3 affecte la méthylation H3K27? Vérification que H3 co-immunoprécipite bien avec CBX2 Reconnaît les protéines exogènes fusions CBX-YN et H3-YC Reconnaît la protéine endogène H3 et la protéine exogène H3-YC Immnuprécipitation (IP) avec anti-Flag (Tag fusionné à CBX2) In=surnageant Etoile: Ac C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que l’interaction entre la protéine CBX2 du complexe PRC1 et l’histone H3 affecte la méthylation H3K27? Question 5: - Quel est l’effet de l’interaction CBX2-H3 sur H3K27me3? Immnuprécipitation (IP) avec anti-Flag (Tag fusionné à CBX2) In=surnageant Etoile: Ac Etoile noir: hybridation no spécifique C. Hartmann & S. Filleur

Est-ce que l’interaction entre la protéine CBX2 du complexe PRC1 et l’histone H3 affecte la méthylation H3K27? Question 5: - Quel est l’effet de l’interaction CBX2-H3 sur H3K27me3? La méthylation de H3K27 est augmentée lorsque l’on a eu formation du complexe CBX2-H3 Immnuprécipitation (IP) avec anti-Flag (Tag fusionné à CBX2) In=surnageant Etoile: Ac Etoile noir: hybridation no spécifique C. Hartmann & S. Filleur

Conclusions sur le rôle de CBX2 dans le polycomb des cellules ES CBX2 est capable d’interagir in vivo avec H3 (BiFC) C. Hartmann & S. Filleur

Conclusions sur le rôle de CBX2 dans le polycomb des cellules ES CBX2 est capable d’interagir in vivo avec H3 (BiFC) L’interaction entre CBX2 et H3 ne dépend pas de la méthylation de H3K27 (BiFC + Cytomètre de flux) Va l’encontre du modèle hiérarchique d’interaction entre PRC1 et H3K27 C. Hartmann & S. Filleur

Conclusions sur le rôle de CBX2 dans le polycomb des cellules ES CBX2 est capable d’interagir in vivo avec H3 (BiFC) L’interaction entre CBX2 et H3 ne dépend pas de la méthylation de H3K27 (BiFC + cytomètre de flux) Va l’encontre du modèle hiérarchique d’interaction entre PRC1 et H3K27 La formation du complexe CBX2-H3 est corrélée à une augmentation de la méthylation de la lysine 27 de H3 (co-immunoprécipitation) Suggère que la méthylation de H3K27 se déroule après l’interaction entre CBX2 et H3 Est-ce que H2AK11ub1 par PRC1 nécessaire à la méthylation de H3K27 par PRC2? C. Hartmann & S. Filleur

Question 6: Quelles autres informations peuvent nous apporter les approches d’interaction protéine-protéine in vivo lors de l’étude de la régulation de l’expression génique? C. Hartmann & S. Filleur

Question 6: Quelles autres informations peuvent nous apporter les approches d’interaction protéine-protéine in vivo lors de l’étude de la régulation de l’expression génique? Permet aussi d’analyser les interactions entre les protéines des voies de signalisation (récepteurs, protéines kinases,…) et facteurs de régulation de transcription génique Exemple de la voie de signalisation par les hormones Acides Gibbérellines (GAs) chez les plantes C. Hartmann & S. Filleur

GID1 et SLR1 deux acteurs de la voie de signalisation GA chez le riz GID1: Récepteur cytosolique des GAs SLR1: Represseur transcriptionnel de la famille DELLA SLR1 est épistatique à GID1 -GA SLR1 Réponse aux GAs GA Question 7: Quel peut-être le lien fonctionnelle entre ces deux protéines dans la voie de signalisation GA? C. Hartmann & S. Filleur

Question 7: Quel peut-être le lien fonctionnelle entre ces deux protéines dans la voie de signalisation GA? Plusieurs acteurs moléculaires peuvent être impliqués entre le récepteur et le répresseur transcriptionnel Approches génétiques (recherche de mutants) Recherche d’interacteurs protéiques de ces deux protéines (Co- IP+MS) Interaction directe Etude de l’interaction entre ces deux protéines C. Hartmann & S. Filleur

GID1 et SLR1 interagissent-elles directement? Co-IP sur cellules de cal transfectées de manière stable avec GID1-GFP BiFC sur cellules d’épiderme de tabac transfectées transitoirement Bright Field GID1-only (negative control) SLR1-only GID1 + SLR1 No GA With GA Question 8: Que pouvez-vous conclure? C. Hartmann & S. Filleur

Question 8: Que pouvez-vous conclure? GID1 et SLR1 interagissent entre elles directement en présence de GA. Cette interaction se fait exclusivement dans le noyau DELLA proteins Growth responses GID1 DELLA degradation Teaching tools for Plant Biology (American Society of Plant Biologists) C. Hartmann & S. Filleur