P Analyse méthylomique prénatale non invasive par séquençage pangénomique au bisulfite de l’ADN plasmatique maternel F.M.F. Lun, R.W.K. Chiu, K. Sun, T.Y. Leung, P. Jiang, K.C.A. Chan, H. Sun et Y.M.D. Lo Novembre 2013 www.clinchem.org/content/59/11/1583.full © Copyright 2013 by the American Association for Clinical Chemistry

Introduction Epigénétique Méthylation de l’ADN Se rapporte aux mécanismes cellulaires et biologiques qui modifient l'expression des gènes ou la fonction exprimée de l'ADN sans modification de la séquence d'ADN. Des exemples de mécanismes épigénétiques comprennent la méthylation de l'ADN, les modifications des histones, le remodelage de la chromatine et les ARN non codants. Méthylation de l’ADN C’est l'un des phénomènes épigénétiques les plus étudiés qui se présente principalement sous la forme de méthylation des cytosinse. Ceci fait référence à l'addition d'un groupe méthyle à l'extrémité carbonée 5’ des résidus cytosines dans les dinucléotides CpG.

Introduction Méthylation de l’ADN et développement La méthylation de l'ADN joue un rôle dans la régulation de l'expression des gènes, la fonction promotrice de gènes, l'inactivation du chromosome X et l'empreinte génomique. Les chercheurs s’intéressent de près au rôle de la méthylation de l'ADN dans la croissance et le développement du fœtus ainsi qu’aux modifications épigénétiques de méthylation aberrante liées à des pathologies fœtales ou associées à la grossesse. Cependant, les tissus fœtaux ou placentaires ne sont pas facilement accessibles à partir de grossesses viables avant terme.

Introduction ADN fœtal libre circulant Pendant la grossesse, de l'ADN provenant en grande partie de cellules placentaires mourantes est libéré dans le sang de la mère. De telles molécules d'ADN fœtal sont présentes parmi une grande quantité d'ADN de la mère dans le plasma maternel. Les molécules d'ADN fœtal circulant sont naturellement libre et existent sous forme de fragments courts. L’ADN fœtal libre est donc une source de matière génétique fœtale qui pourrait être prélévé de manière non invasive à partir d’un échantillon de sang de la mère.

Question De nombreux travaux portent sur l’étude du profil de méthylation de l’ADN de tissus placentaires Qu’est-ce que les chercheurs ont découvert à ce jour ? Quel est l’impact des anomalies de la méthylation de l'ADN sur le développement de la grossesse, le fœtus ou le nouveau-né ?

Matériels et méthodes Analyse méthylomique fœtal et placentaire non invasive Des échantillons de sang périphérique ont été prélevés sur une femme enceinte au cours du premier trimestre, du troisième trimestre et après l'accouchement. L’ ADN plasmatique maternel a été soumis à un séquençage massivement parallèle au bisulfite. Les procédures de bioinformatique ont été appliquées pour différencier les profils de méthylation fœtale et placentaire de celui de l'ADN maternel.

Question Décrire les deux approches différentes utilisées dans cette étude pour déterminer le profil de méthylation fœtale/placentaire à partir de plasma maternel malgré la présence de quantité importante d'ADN maternel

Matières et méthodes Détection de la trisomie 21 par séquençage au bisulfite de l’ADN plasmatique Des échantillons de sang périphérique ont été prélevés sur des femmes enceintes qui se présentaient pour un dépistage prénatal du syndrome de Down. L’ADN plasmatique maternel a été soumis à un séquençage massivement parallèle au bisulfite. La densité de méthylation des molécules d'ADN plasmatique dérivées du chromosome 21 a été normalisée par les densités de méthylation des autres chromosomes.

Résultats Profilage pangénomique non invasif du méthylome placentaire Grâce à l'analyse du plasma maternel, le profil de méthylation du tissu placentaire a été déterminé avec succès d'une manière pangénomique. Le caractère non invasif de cette approche a permis de suivre périodiquement les changements du profil de méthylation du tissu placentaire au cours de la grossesse comme le montre la grossesse étudiée. Il a été montré que l’ADN placentaire est hypométhylé.

Profil de méthylation pangénomique d’échantillons du premier trimestre Figure 1. Graphes de circos de la densité de méthylation par plateau de 1 Mb. Les idéogrammes chromosomiques (anneau le plus externe) sont orientés pter-qter dans le sens des aiguilles d’une montre (les centromères sont indiqués en rouge). Le deuxième tracé extérieur indique le nombre de sites CpG dans les régions de 1 Mb correspondant jusqu'à 20 000 sites. Les densités de méthylation des régions de 1 Mb correspondantes sont présentées dans les autres tracés en se basant sur le schéma de couleurs qui figure au centre. De l'intérieur vers l'extérieur : échantillon de villosités choriales, lectures spécifique au fœtus dans le plasma maternel, lectures partagées dans le plasma maternel, lectures combinées fœtales et non-fœtales dans le plasma maternel et cellules de sang maternel.

Résultats Applications L'étude montre également que les données ont permis l'évaluation non invasive de la trisomie 21, le statut d’empreinte des gènes, les changements dépendants de l’âge gestationnel en termes de méthylation de l'ADN des loci génétiques, la relation entre la méthylation de l'ADN et la taille des fragments d'ADN plasmatique et la recherche non invasive pour des marqueurs de méthylation spécifiques des tissus placentaires. D'autres applications potentielles sont également décrites dans le commentaire de l’éditorial qui accompagne l'article.

Figure 2. Détection de la trisomie 21 Figure 2. Détection de la trisomie 21. Graphique des densités normalisées de la méthylation du chromosome 21 d’échantillons de plasmas maternels prélevés sur des femmes avec des grossesses euploïdes et présentant une trisomie 21.

Tableau 2. Nombres de loci différentiellement méthylés de tissu placentaire prédits à partir des données de séquençage de l'ADN plasmatique maternel.

Figure 3. Densités de méthylation et tailles des molécules d’ADN plasmatique. Plasma maternel au premier trimestre. Les données pour toutes les lectures séquencées qui ont couvert au moins un site CpG sont représentées par la courbe bleue. Les données pour les lectures qui contenaient également un allèle de SNP spécifique au fœtus sont représentées par la courbe rouge. Les données pour les lectures qui contenaient également un allèle de SNP spécifique à la mère sont représentées par la courbe verte.

Question Quelles sont les autres applications qu’on pourrait explorer avec les méthodologies développées dans cette étude ?

Editorial d’accompagnement : Oudejans C.B.M. Maternal Plasma Bisulfite DNA Sequencing: Tomorrow Starts Today. Clinical Chemistry 2013;59:1547-9.

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