Analyse nips Non invasive prenatal sequencing Diagnostic prénatal non invasif des trisomies 13,18 et 21 à partir du sang maternel Olivi M., Mallek R., Moukoury S., Kleinfinger P., Lohmann L., Costa J.M. Unité de biologie moléculaire génomique, laboratoire CERBA, Saint-Ouen-l'Aumône Septembre 2015

Sommaire Concept Réalisation du test Validation Process routine Perspectives 1

Concept du test: ADN fœtal plasmatique Origine cellulaire: les cellules cyto/syncytiotrophoblastiques Apparition (détection) précoce dans la circulation maternelle ≈ 5-6SA Quantité augmente avec le terme de la grossesse Disparition rapide (< 48 h) après accouchement (1/2 vie 16 min) Pas de persistance après grossesse Fetal cell Cell isolation Selon Bodurtha J, Strauss JF III. N Engl J Med 2012;366:64-73. 2

Concept du test: Pourquoi faire du DPNI? Réduire le risque induit par le geste invasif Perte fœtale Diminuer le nombre de gestes invasifs Améliorer le dépistage Risque combiné 1er trimestre: âge maternel + mesure de la clarté nucale +marqueurs sériques maternels Développer les approches non invasives Imagerie fœtale Analyse biologique du fœtus à travers un prélèvement maternel 3

Concept du test: Analyse de l’Adn fœtal circulant Détermination du sexe Fœtal: Maladies génétiques liées à l’X Hyperplasie congénitales des surrénales (déficit en 21-hydroxylase) Ambiguïtés sexuelles échographiques, discordances caryotypes/échographie Intérêt: DPN uniquement chez fœtus masculin Génotypage RHD et Kell Allo-immunisation Intérêt: environ 35% des fœtus sont RhD-négatifs Mutations DE NOVO Achondroplasie Hypochondroplasie YX XX K1/K2 K1/K1 K2/K2 RHD+ RHD- ADN fœtal Analyse qualitative (Recherche de marqueurs fœtaux absents du génome maternel ) 4

Concept du test: Analyse de l’Adn fœtal circulant Analyse qualitative (Recherche de marqueurs fœtaux absents du génome maternel ) Analyse quantitative (Sur-représentation chromosomique fœtale) Aneuploïdies PCR temps réel ( Fret,HRM) et SNaPshot 5

Concept du test: ADN fœtal plasmatique Challenge: mise en évidence d’une sur-représentation chromosomique dans l’ADN circulant lorsque le fœtus est porteur d’une aneuploïdie Les difficultés Quantité faible 1er trimestre: 20-30 Geq/ml Fraction fœtale: 5-10% Age gestationnel Indice de masse corporelle Anomalies chromosomiques et/ou placentaires Ethnie? Ne peut pas être isolé 6

Concept du test: 1997 Découverte ADN fœtal plasmatique ? 2011 Diagnostic non invasif de la trisomie 21 (USA) 2013 NIPS (non invasif prénatal sequencing-CERBA) 7

Concept du test: une rupture technologique SEQuençage a haut débit (Massive Parallel Sequencing) Par run Séquençage SANGER Séquençage NGS Petit débit Haut débit Ratio Instrument ABI3130XL Illimuna MiSeq Illimuna 1500 Taille des fragments 500bp 27bp Durée 6h 5h 34h Nombre de reads 96 25 millions (single reads 36bp) 1.5 milliards (single reads 27bp) Capacité 50KB (50 10+3) 15GB (15 10+9) 300GB (300 10+9) X 300 X 6.000.000 ARIANE 5 21.500CH Génome humain 3GB Exome humain 30MB AUDI A1 105CH 8

Concept du test: dosage chromosomique relatif par MPS Mesure de fraction chromosomique Comparaison statistique par rapport à une valeur attendue Fan HC, Quake SR. Sensitivity of noninvasive prenatal detection of fetal aneuploidy from maternal plasma using shotgun sequencing is limited only by counting statistics. PLoS One. 2010 May 3;5(5):e10439 9

Analyse Bio-informatique réalisation du test Pré Analytique ADN foetal Extraction Préparation librairie Sequençage (HiSeq1500) Résultat Analyse Bio-informatique J-x J1+J2 J4 Calcul de la fraction chromosomique =%21 séquences de l’échantillon par rapport au total des chromosomes Calcul du Z-score distance entre le score brut et la moyenne de la population =%21sample-mean%21référence/SD médiane%21référence Interprétation Trisomie 21 10

Préparation des l’échantillons J-x réalisation du test Extraction manuelle de l’ADN plasmatique Enrichissement Purification compatible avec les réactions enzymatiques ultérieures Préparation des l’échantillons J-x Pré Analytique Tube 1 pour extraction Tube 2 pour sauvegarde Extraction ADN foetal Two groups have reported encouraging results although in small « proof of concept » studies. The Stephan Quake’s group from Standford University first and the Dennis Lo’s group from HK University then, correctly identified all fetuses affected by trisomy 21 by using two different platforms and two statistical methods. Par batch de 24 (x4) Mise en plaque 96 soit: Contrôle négatif (NTC No Template Control): 4 Contrôle normal (NPP Normal Pool Plasma): 4 Plasma patientes: 88 11

réalisation du test (J1) Préparation de la librairie J1 Purification et dilution Un index unique par échantillon Enrichissement B Stock plate Two groups have reported encouraging results although in small « proof of concept » studies. The Stephan Quake’s group from Standford University first and the Dennis Lo’s group from HK University then, correctly identified all fetuses affected by trisomy 21 by using two different platforms and two statistical methods. A HT DNA 1K/12K/HiSen Chip C moyenne: [nmol/l] Dilution plate Quantification des librairies 12

réalisation du test 13 Préparation de la librairie (J2) Normalisation Work plate Normalisation [1,6nmol/l] Multiplexage Two groups have reported encouraging results although in small « proof of concept » studies. The Stephan Quake’s group from Standford University first and the Dennis Lo’s group from HK University then, correctly identified all fetuses affected by trisomy 21 by using two different platforms and two statistical methods. Un témoin « low positif » par ligne, soit 8 par flow cell: Trisomie 21 Trisomie 18 Trisomie 13 PhiX 13

réalisation du test 14 Clusterisation (J2) sur la flow cell Dénaturation des doubles brins générés Elimination de la matrice originale Le brin nouvellement synthétisé est fixé de manière covalente à la FC Hybridation des librairies simple brin aux amorces fixées sur la Flow Cell Copie du brin fixé (polymérase) Surface en verre de la FC revêtue des oligos sens et antisens Two groups have reported encouraging results although in small « proof of concept » studies. The Stephan Quake’s group from Standford University first and the Dennis Lo’s group from HK University then, correctly identified all fetuses affected by trisomy 21 by using two different platforms and two statistical methods. 14

réalisation du test 15 Clusterisation (J2) La molécule simple brin se plie pour s’hybrider à l’amorce complémentaire adjacente Extension du brin complémentaire par la polymérase Formation du « pont » double brin Les extrémités 3’ sont bloquées pour éviter qu’elles se re-hybrident Dénaturation des « ponts » Les brins « antisens » sont clivés et éliminés. Ne reste que les brins « sens » Two groups have reported encouraging results although in small « proof of concept » studies. The Stephan Quake’s group from Standford University first and the Dennis Lo’s group from HK University then, correctly identified all fetuses affected by trisomy 21 by using two different platforms and two statistical methods. 15

Terminateur réversible (CRT: Cyclic Reversible Terminator) réalisation du test Séquençage ( de J2 à j4) Les brins séquencés sont éliminés Déblocage des extrémités 3’ Hybridation du primer de séquençage à son brin complementaire Terminateur réversible (CRT: Cyclic Reversible Terminator) Boxes Pass Filter  Boxes Clusters  Two groups have reported encouraging results although in small « proof of concept » studies. The Stephan Quake’s group from Standford University first and the Dennis Lo’s group from HK University then, correctly identified all fetuses affected by trisomy 21 by using two different platforms and two statistical methods. Single read: 27 cycles + 8 pour Index (run: 35heures) vidéoI llumina:https://www.youtube.com/watch?v=HMyCqWhwB8E 16

Analyse des données 17 analyse (j4) Sequencing Result Pipeline informatique Conversion des images en séquence Démultiplage Alignement contre le genome humain (hg19) ANALYSE Calcul de la fraction chromosomique =%21 de l’échantillon par rapport au total des chromosomes Calcul du Z-score: représente la distance entre le score brut et la moyenne de la population =%21sample-mean%21référence/SD médiane%21référence Mesure de la fraction d’ADN fœtal TCCGCCCAGGCCATGAGGGACCTGGAAATGGCTGAT x9 10+6/échantillon 17

Dosage chromosomique fœtal par mps Calcul du Z-score =%21sample-mean%21référence/SD médiane%21référence 21 Distribution « normale « des séquences pour la population de référence 99,8% Un Z-score de 3 signifie que la valeur mesurée est distante de 3 écarts-types de la valeur cible. La probabilité de trouver une valeur à l’extérieur est de 0,17% pour une distribution normale. Si une valeur est à l’extérieur, cela ne peut s’expliquer par les simples fluctuations statistiques. Z-score >3 signe une sur-représentation chromosomique 18

Réalisation du test et validation Critères de validation du run Témoins NTC Témoins normaux NPP Témoins « low » Positifs Critères de validation individuels Concentration de la librairie >7,5nM Total counts (reads) > 9 millions Mesure de la fraction fœtale > 4% Analyse des Z-scores 19

Synthèse validation du test NIPS cerba Questions avant la mise en place du test: Quelles sont les performances du test ? A qui peut-on ou doit-on proposer ce test ? Jusqu’où aller dans l’analyse? Sous quelles conditions? Validation: 1- Vérification du process Echantillons: 176 Trisomie 21: 6 Trisomie 18: 2 Trisomie 13: 2 Mise en contrôle: 4 Collaboration SEQUENOM Transfert technologique Validation de la faisabilité et des compétences techniques 20

Synthèse validation du test NIPS cerba 2- Vérification des performances (étude pré-clinique multicentrique SHREK, patientes à risque) comparaison test NIPS Cerba vs caryotype fœtal (gold standard) Population mixte: caryotype fœtal connu + patientes à risque devant subir un geste invasif Clarté nucale élevée Signe d’appel échographique autre que nuque Marqueurs sériques ≥ 1/250 Antécédent personnel ou pour le couple d’anomalie chromosomique Age maternel>38 ans Echantillon sanguin prélevé soit à priori, soit en post-caryotype Age médian 37 ans (range 23-50) Terme médian 13SA (range 11-31) 21

Synthèse validation du test NIPS cerba 29 CPDPN + Belgique et Monaco Synthèse validation du test NIPS cerba 3- Validation clinique (étude multicentrique SEHDA, patientes à risque) Coordination et collection des données: Pr A Benachi et Dr A Letourneau (Hôpital Antoine Béclère, Clamart) Comparaison test NIPS Cerba vs caryotype fœtal Population mixte: caryotype fœtal connu + patientes à risque devant subir un geste invasif Clarté nucale élevée Signe d’appel échographique autre que nuque Marqueurs sériques ≥ 1/250 Antécédent personnel ou pour le couple d’anomalie chromosomique Age maternel>38 ans Echantillon sanguin avant geste invasif (amniocentèse ou CVS) Terme moyen : 16.2SA (range 10-35) Age moyen : 35 ans (range 18-49) ACCREDITATION COFRAC: avril 2015 22

Dépistage combiné du 1er trimestre vs NIPS ETUDE DEPOSA: Dépistage combiné du 1er trimestre vs NIPS en population générale grossesse spontanée vs assistance médicale à la procréation DEPOSA Etude multicentrique, Etude prospective (durée 18 mois), Etude interventionnelle, Promoteur: AP-Hôpitaux de Paris Autorisation ANSM: 2014-AO1594-43 Investigateur coordonnateur : Alexandra BENACHI Responsable Scientifique: Jean-Marc COSTA Financement: Agence de la Biomédecine, Laboratoire CERBA, Laboratoire SEQUENOM, Intériale Mutuelle 23

EN ROUTINE au Laboratoire CERBA Absence d’anomalies échographiques Terme ≥ 10SA Patientes à risque accru (recommandations) Dépistage par les marqueurs sériques ≥ 1/250 Antécédent pour le couple d’une grossesse avec aneuploïdie 13,18 ou 21 Couple dont l’un des membres est porteur d’une translocation robertsonienne impliquant un chromosome 13 ou 21 Patiente âgée de plus de 38 ans n’ayant pas pu bénéficier du dépistage sérique Patientes à bas risque: indications retenues Grossesse gémellaire Dépistage par les marqueurs sériques: avec un marqueur hors norme (sous-évaluation du risque) Résultat Actuellement trisomie 13, 18 et 21 Ne sont pas communiqués: anomalies des gonosomes et sexe fœtal, autres aneuploïdies (trisomie 16 et 22) et syndromes micro-délétionnels. Tout résultat positif nécessite un contrôle sur prélèvement invasif Ce test ne doit pas se substituer actuellement au dépistage par les marqueurs sériques et à l’échographie du 1er trimestre 24

Résultat non exploitable: EN ROUTINE au Laboratoire CERBA Nombre de tests: 2014: 3319 Août 2015: 3702 Tests réalisés: 1994 (fin août 2014) Centres>570 Prescripteurs>90 Marqueur sérique 1488 Age maternel 208 Antécédent 109 Divers 189 Contrôle: 9 Résultat non exploitable: 1 soit 0,05% (IMC: 27,3) Négatif: 1925 Anomalie: 68 Soit 3,41% Trisomie 21 N=54 Trisomie 18 N=10 Trisomie 13 N=4 AU TOTAL : réduction de 96,6% des gestes invasifs 25

faut-il proposer ce test à toutes les patientes? Sensibilité et spécificité supérieure à celle du dépistage par les marqueurs sériques maternels Détection de plus de fœtus porteur d’une trisomie 21 Dépistage « conventionnel » : 80-85% Dépistage génétique : >99% Diminution du nombre de gestes invasifs Dépistage « conventionnel » : 4% (soit 30.000 femmes/an en France) Dépistage génétique : 0,4% (soit 3.000 femmes/an en France) Diminution du nombre de pertes fœtales iatrogènes 26

Pourquoi ne peut-on pas proposer ce test à toutes les patientes? Coût (650€) Délai de résultat: de 7 jours à 14 jours Accessibilité au test (lire avis n°120 du CCNE) Respect des recommandations nationales Comité Consultatif National d’Ethique. Avril 2013 Collège National des Gynécologues et Obstétriciens Français. Avril 2013 Questions éthiques associées au développement des tests génétiques fœtaux sur sang maternel Peu d’étude en population générale (DEPOSA en cours) Impact sur la valeur prédictive positive du test Formation et information des professionnels de santé 27

Perspective à court terme : l’étude complète du génome fœtal Dosage chromosomique fœtal par mps: vers un caryotype complet… 28

Avantage DE L’APPROCHE « whole genome » Femme de 40 ans Echographie 12+5: clarté nucale à 3,8mm Biopsie de villosités choriales 13+2 Examen direct : 46,XX Culture: délétion interstitielle du bras court d'un chromosome 10 entre les bandes 10p12 et 10p14 29

DPNI et dérives «Marché» accessible via internet Séquençage complet: faisabilité technique et offre déjà existante