Diagnostic Biologique des Leishmanioses Pr F.BACHI Biologie Parasitaire, Institut Pasteur d’Algérie Journée de Formation Médicale Continue Annaba, le 26 Novembre 2015

Les Leishmanioses : Actualités Diagnostic??

Introduction Pourquoi Actualités ??? Est que les outils disponibles ne sont plus suffisants ?? Nécessité d’améliorer Pourquoi ??

Epidémiologie Nouveaux foyers: Modifications climatiques Déplacements des populations Immunodépressions Age: Nourrissons: moins de 1an ( 03mois) Adolescents et adultes jeunes: 14-16ans et 40ans Statut immunitaire: Immunodéprimés SIDA Autres type d’immunodépressions : Corticothérapie à long terme Greffe d’organe Diagnostic et pronostic

Clinique: Tableaux atypiques Triade symptomatique Fièvre isolée au long cours Formes digestives: Hépatomégalie Formes pulmonaires Tableaux atypiques

Polymorphisme clinique de la leishmaniose cutanée

Quoi de neuf dans le diagnostic de la LV?? Diagnostic Biologique de la Leishmaniose Viscérale: Biologique non spécifique Diagnostic immunologique Diagnostic parasitologique

Diagnostic Biologique non spécifique FNS: Pancytopénie Pas toujours!!!! Syndrome inflammatoire: Le même Protidogramme: Dysprotéinémie , HypoAlb et Hyperγglob Anomalie hépatique: Formes digestives Forme ictérique Transaminases: élevées & signes de rétention Cytolyse Insuffisance hépatique Mauvais pronostic

Diagnostic immunologique Immunofluorescence Indirecte: IFI Promastigote de Leishmania Technique de référence Seuil de positivité : 1/80 Sensibilité: 28,4% - 86% Mais attention Nourrissons Immunodéprimés Enzym Linked Immuno Sorbent Assay: ELISA

Plusieurs variantes Technique immunoenzymatique Enzym Linked Immuno Sorbent Assay: ELISA Technique immunoenzymatique Ag soluble brut: Ag membranaire & Ag cytoplasmique(Ag AS) Automatisée( grand nombre de prélèvement) Sensibilité & spécificité : Antigène utilisé Ag ES ( métabolique) Ag Purifié Ag recombinant Plusieurs variantes

Les Variantes de l’ELISA Ld-ESM ELISA: Sensibilité & Spécificité :100% VPP: 99,99% & VPN : 95,45% rGBP ELISA: gène B L.major ( homologue du gène B de L. donovani Ld- rGBP ) rORFF ELISA: gène de L.infantum Comparée au DAT et SA ELISA: plus sensible Utilisée en Inde ( très sensible & très spécifique) Croise dans 40% des cas : L.major & L. tropica en Turquie rGp63 de L.major rK39 ELISA: gène kinésine spécifique du complexe donovani Sensibilité élevée & excellente VPP rK26 & rK9 : gène kinésine de L. chagasi rKE16 : L. donovani en Inde 100% Sensibilité & Spécificité 100% Concordance avec rK39 en Chine, Pakistan et Turquie Sarman Singh Indian J Med Res 2006

rK39 ELISA Excellente VPP chez Les Immunodéprimés (SIDA) Soudan: Sensibilité 7% rK39 en méthode immunochromatographique: Soudan: Sensibilité 67% Sud de l’Europe: 71,4% Brésil: 60 – 90% Sarman Singh Indian J Med Res 2006

2 Tests avec le même Ag: rK39 Tests Rapides: 2 Tests avec le même Ag: rK39 Sous 2 formes 2 techniques de principes différents Le IT- Leish : Immunochromatographique Le ID – PaGIA Leishmaniasis : Agglutination

ID-PaGIA: 11% Sujets contacts P. Marty et al, Med Trop 2007

Le KAtex: KAtex: Kala –Azar & Latex Anticorps polyclonal fixé aux particules de Latex Ag urinaire Spécifique Ag thermostable non protéique Carbohydrate de 5 -15 kDa: produit de dégradation du LPG, aPPG & Pppg Sensibilité : 80% Spécificité: 100% Phase active: Diagnostic précoce, stade préclinique Disparait précocement au cours du traitement: suivi thérapeutique M. Hommel et al, Med Trop 2001

Western Blot: Immuno-empreinte Ag soluble: promastigote de culture Electrophorèse en SDS Page Electrotransfert sur nitrocellulose Immunodétection Technique très sensible, très spécifique Bandes de valeur Diagnostic: 14 – 16 kDa 30 – 46 kDa 90 kDa Bandes Indice épidémiologique: 22 – 24 kDa T+ T- Critères pronostics 51 kDa après traitement: Mauvais pronostic Présence d’IgE spécifiques: Activité de la maladie

Diagnostic parasitologique Diversité des prélèvements: PMO – Sang – LBA – PBF ….. Diagnostic de certitude Techniques Frottis coloré au MGG Culture sur milieu spécifique Leuco - Cyto - Concentration: LCC Plus sensible chez le sujet immunodéprimé ( SIDA) La Biologie Moléculaire: Ne règle pas les problèmes

La Biologie Moléculaire: Ne règle pas les problèmes Recherche l’ADN de Leishmania dans divers produits pathologiques Très sensible: Problèmes d’interprétation Faux positifs Portage asymptomatique en zone d’endémie Parasites morts Très spécifique: Choix de l’amorce

Les amorces de Leishmania Amorce sens S Amorce anti sens R cibles Taille (paires de bases) B1-B2 minicercle ADNk 750 pb M1L-M3HL 75 pb Min11-Min22 Région Subtelomerique d’ADNr 491pb R221-R322 DNAr 603 pb PO3-PO5 région multicopies d’ADN JW11 JW12 LU-5A-LB-3 C sequence d’ARNr 146–149 bp K13A-K13B ADNk 120 pb RV1-RV2 minicercle ADNk (10,000 copies) 145pb GFP-GRP(V) Lei70L-Lei70R 345pb Pia3-Pia4 Sequence d’ARNr L. infantum 260pb Pia1-Pia2 100pb Deb8-AJS3 minicercle ADNk (10,000copies) 809pb

Travail réalisé à l’IPA: 77 Patients suspects de Leishmaniose viscérale IFI, WB, PCR Avec deux amorces différentes ( R221/R322 et K13A/K13B) Résultats : PCR ribosomale : positive 10,38% des cas PCR Kinétoplastique: positive 35% des cas PCRR221/322 PCR K13A/K13B Positive Négative Total 8 42 50(35%) 27 8 (10,38%) 69 77

Statut VIH Non VIH Total Positive 7 (11,86%) 1(5,55%) Négative   PCRR221/322 VIH Non VIH Total Positive 7 (11,86%) 1(5,55%) 8 Négative 52(88,13%) 17(94,44%) 69 59(100%) 18(100%) 77 Statut PCRK13A/K13B VIH Non VIH Total Positive 40(67,79%) 10(55,55%) 50 Négative 19(32,20%) 8(44,44%) 27 59 18 77 On note à travers ce tableau que la PCR utilisant la sonde ribosomale n’a été positive que chez 8 patients sur un total de 77 soit 10,38% des cas seulement et comparativement à l’IFI (31,16% de positifs) elle serait moins sensible.

WB PCRR221/R3 32 Positif Négatif Total Positive 3 Négative 34 20 54 37 57 WB PCR K13A/K13B Positif Négatif Total Positive 30 4 34 Négative 7 16 23 37 20 57

IFI N=77 Sensibilité Spécificité VPP VPN PMO N=14 77,77% 100% 71,42% 35% 80% 83,33% 30,18% WB N=57 88% 70% 81% R221/332 N=77 13% 23,18% K13A/K13B N=77 79,24% 66,66% 84% 59%

En Pratique et en Algérie?? FNS Diagnostic séroimmunologique: IFI ELISA Western Blot Diagnostic direct : PMO – Sang Frottis ( Lu par un parasitologue) Culture

Diagnostic de la leishmaniose cutanée

Diagnostic: Frottis cutané Culture IDR à la Leishmanine

Conclusion Tous ce qui brille n’est pas OR Technique nouvelle : évaluer Algorithme décisionnel: ensemble de techniques complémentaires Interprétation des résultats: fonction des données Epidémiologique Clinique Biologique

Merci pour votre aimable attention