HIV: diagnostic virologique et suivi des patients infectés Cours D1 2011-2012.

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1 HIV: diagnostic virologique et suivi des patients infectés Cours D1 2011-2012

2 Diagnostic Indirect = Détection d’Ac par différentes techniques Diagnostic Direct = Détection du virus ou de ses composants - Technique ELISA - Western-blot « Dater l’infection » Infection récente « Déjà vu le virus » Statut sérologique Isoler le virus Détecter les Ag Détecter le génome Culture cellulaire - Immunofluorescence - Technique ELISA PCR RT-PCR

3 qTechniques qDiagnostic virologique d’une infection VIH  chez l’adulte qSuivi virologique d’un sujet infecté par le VIH DIAGNOSTIC ET SUIVI VIROLOGIQUES HIV

4 Les techniques  1) Techniques de diagnostic indirect  Techniques de recherche des anticorps anti VIH  Tests de dépistage : techniques ELISA  Tests rapides  Tests de confirmation: test sur bandelette (Western blot ou test apparenté)  2) Techniques de diagnostic direct  Techniques permettant la mise en évidence du virus lui-même:  Antigénémie P24  ARN plasmatique  DNA proviral  Tests de résistance du virus aux ARV: technique de séquençage

5 Principe général de l’ELISA plaque antigène AC anti VIH AC non spécifique « conjugué » : AC anti Ig humaine Couplé à une enzyme Contact de l’enzyme avec un chromogène : Réaction colorée

6 Principe de l’ELISA  - phase solide revêtue d'antigènes VIH  - les anticorps anti-VIH se lient sur les antigènes  - révélation par :. des Ac anti-Ig humaines conjugués à une enzyme. puis le substrat chromogène est ajouté  si Ac anti-VIH :  coloration de la cupule grâce à un chromogène soluble

7 Test de dépistage VIH = technique ELISA Tests ELISA de 4ème génération: Caractéristiques:  Test mixte = HIV1 et HIV2  Test combiné = détecte  les AC  et en même temps l’antigène p24 Particularité de ce dépistage VIH

8 Tests rapides  Test immunochromatographique ou par immunofiltration:  Antigènes recombinants et peptides de synthèse immobilisés sur une membrane  Dépôt du sérum contenant éventuellement des AC spécifiques  Migration du sérum jusqu’aux AG immobilisés  Liaison des AC avec les Ag donnant une coloration visible à l’œil nu  Moins sensibles que l’ ELISA  Détection des AC anti VIH1 et 2 (pas de détection de l’Ag p24)

9 Principe du TDR Immuno - chromatographie Test Determine Immuno - filtration Test INSTI Bande témoin Bande HIV - +

10 Test de confirmation  Confirme la spécificité antigénique des anticorps détectés en ELISA  Le test utilisé classiquement est le Western Blot  On peut également utiliser un immunoblot avec des protéines recombinantes et des peptides synthétiques  Bandelette de nitrocellulose sur laquelle les principaux antigènes  viraux sont séparés et disposés en bande  Lorsque les AC correspondants sont présents dans le sérum: réaction  Ag/Ac et visualisation de la bande  Des critères de positivité ont été définis (OMS)

11 Profil western blot GP 160 GP 120 P 68 P 55 GP41 P 40 P 34 P 25 P 18

12 Western Blot HIV2 HIV1

13 Test de confirmation pouvant remplacer le Western Blot

14 Test confirmation pouvant remplacer le Western Blot Bandes spécifiques du VIH1 Bandes spécifiques du VIH2 Bandes témoins de la réaction

15 Techniques de mise en évidence du virus  Antigénémie P24  Quantification de l’ARN VIH plasmatique  = charge virale plasmatique  Recherche (quantification) du DNA proviral

16 Différents états du VIH Virus intégré Réplication  DNA proviral CV plasmatique  Quantification de l’ARN plasmatique (PCR quantitative) Virus plasmatique + Ag soluble  Ag p24

17 Antigénémie P24  L'antigénémie P24 constitue un marqueur de réplication virale  Elle détecte les antigènes solubles produits en même temps que les particules virales lors de la réplication virale  La technique est un test ELISA qui met en évidence les antigènes HIV présents dans le sang

18 Charge virale  Dans le sang, évaluation de la charge virale : cellulaire : quantité de virus dans les cellules mononuclées = réservoir de virus plasmatique : quantité de virus libre dans le plasma = marqueur de réplication  Ces charges virales cellulaires et plasmatiques peuvent être évaluées par : des techniques de culture en dilution limite abandonnées au profit des techniques de biologie moléculaire Basées sur le principe de la PCR

19 Principe de la PCR  Amplification exponentielle d’un ADN cible  20 à 40 cycles d’amplification  Chaque cycle comprend 3 étapes: ØDénaturation de l’ADN par la chaleur à 95° : séparation des 2 brins ØHybridation avec 2 amorces de 10 à 20 nucléotides encadrant la région à amplifier ØÉlongation à partir des amorces grâce à une enzyme thermostable agissant à 72°

20 dNTP Taq polymérase Amorces Tampon Matrice ADN 95°C55°C72°C DénaturationHybridationElongation 30 cycles

21 Principe de la PCR

22 1 - Extraction 2 - Amplification 3 - Quantification Quantification de l’ARN VIH plasmatique: = Charge Virale plasmatique ARNADN

23 Quantification de l’ARN VIH plasmatique: = Charge Virale plasmatique  Prélèvement de sang sur anticoagulant (EDTA)  Centrifugation pour obtenir le plasma  Extraction de l’ARN des virus présents dans le plasma  RT PCR quantitative:  Technique de PCR en temps réel  Utilisation d’un standard interne

24 Roche Abbott Charge virale: plateformes automatisées Extraction ARN plasmatique Quantification par PCR temps réel Quantifie: HIV1 groupe M, O, N Ne quantifie pas HIV2 Quantifie: HIV1 groupe M, O, N Ne quantifie pas HIV2

25 Charge virale VIH  Résultats exprimés en nombre de copies / ml ou en log de ce nombre de copies / ml  Seule une différence de 0.5 log entre 2 résultats peut être considérée comme significative  Seuil de détection : 40 copies / ml  Pour un meilleur suivi, il est recommandé d’utiliser des résultats de tests obtenus par la même technique et si possible par le même labo  Les VIH 2 ne sont pas quantifiés par les techniques commercialisées

26 PCR - précautions qRisques de contaminations  Problème majeur de ces techniques:  contamination par les produits amplifiés d’une manip précédante ØBonnes pratiques +++ : précautions dans les manipulations, pièces dédiées, système Ampérase. qRésultats faussement négatifs:  Peuvent être liés à la présence de substances inhibitrices dans les prélèvements ØTechniques d’extraction du matériel génétique avant amplification sont capitales

27 Diagnostic virologique d’une infection HIV chez l’adulte

28 Diagnostic d’infection VIH chez l’adulte qPremière étape : dépistage  Permet la mise en évidence dans le sang périphérique: Ødes AC spécifiques dirigés contre les protéines de structure du virus Øde l’antigène p24 qDeuxième étape : confirmation

29 Évolution des marqueurs virologiques dans le sang périphérique au cours du temps Seuil de détection des marqueurs Variable selon les techniques Anticorps ARN plasmatique Antigène P24 Temps en jours J0 (contage) J12J14-15 J20-21

30 Détection des différents marqueurs virologiques au cours de la primo-infection J0 : contage Fenêtre silencieuse J12-14: ARN plasmatique J15-16: pic d’Ag P24 Dure environ 10 jours J 20-21: AC antiVIH par ELISA 3° génération J25-26: AC anti VIH par WB temps Tests ELISA 4° génération Charge virale Tests rapides

31 Algorithme de dépistage d’une infection VIH chez l’adulte Un seul test : ELISA 4ème génération - + Test de confirmation sur le même sérum (Western Blot ou test immunoblot apparenté) + Contrôle de la sérologie sur un 2ème prélèvement: = Test ELISA 4ème génération Résultat rendu positif Négatif ou indéterminé 2ème prélèvement à 15 jours CV éventuellement Résultat rendu négatif (Sous réserve abs de contage dans les 6 semaines précédentes)

32 Interprétation du test de confirmation  moins sensible que l’ELISA  reste cependant obligatoire pour le diagnostic  test de confirmation positif: nouveau dépistage sur un  2° prélèvement obligatoire pour affirmer le diagnostic de séropositivité VIH  Test de confirmation indéterminé: plusieurs hypothèses

33 Test de confirmation indéterminé qInfection par VIH2 ØWestern blot spécifique VIH2 qSéroconversion en cours ØAg P24, et surtout actuellement CV ØÉvolutivité des tests AC sur un 2° prélèvement 15 jours plus tard qRéactivité non spécifique ØSeulement après avoir éliminé les autres hypothèses

34 Utilisation de la Charge virale dans le dépistage  La CV n’est pas utilisée pour faire un dépistage HIV sauf  Exceptionnellement en cas de suspicion de primo-infection Après discussion avec le clinicien

35 Règles à respecter pour le dépistage  q Consentement obligatoire qConfidentialité absolue qDépistage obligatoire pour : don de sang, de sperme, de tissu ou d’organe qDéclaration anonymisée des positifs

36 Suivi virologique d’un patient infecté par le VIH 2 techniques virologiques sont utilisées en routine pour le suivi des sujets infectés:  Charge virale  Test de résistance génotypique

37  Le taux de CD4 + représente:  La distance qui sépare le véhicule du précipice  La charge représente:  La vitesse du véhicule  La réponse immunitaire et le traitement anti-rétroviral représentent:  Les freins Taux de CD4 + 100 200 400 800 1000 Charge virale 1000 10 000 100 000 Patient infecté par VIH

38 Charge virale plasmatique La charge virale représente:  Un marqueur pronostic  Un marqueur permettant de suivre l’évolution de la maladie  Un marqueur permettant de suivre l’efficacité d’un traitement antirétroviral

39 Suivi virologique d’un patient infecté par VIH   patient non traité ==> Charge virale tous les 4 à 6 mois si CD4 > 500/mm 3 ==> Charge virale tous les 3 mois si CD4 < 550/mm 3  Mise sous traitement -Test génotypique de résistance - CV initiale  Suivi de l’efficacité du traitement CV 1 mois après le début du traitement puis tous les 3 mois la 1° année Le but est d’obtenir une CV indétectable (<50 copies/ml) au-delà d’un an de TRT: CV tous les 3 à 6 mois selon la clinique et les CD4 Echappement virologique = CV redevient détectable tests de résistance aux ARV (et dosages pharmaco)

40 Cycle réplicatif et traitements Liaison au récepteur et au corécepteur fusion Rétrotranscription Intégration Transcription épissage Traduction Bourgeonnement Maturation ARN ADN Inhibiteurs de RT Inhibiteurs De protease Inhibiteurs D’entrée Inhibiteurs D’intégrase Réverse Transcriptase Intégrase Protéase  Inhibiteur du corécepteur CCR5  Inhibiteur de fusion  Inhibiteurs nucléosidiques de RT  Inhibiteurs non nucléosidiques de RT

41 Le VIH a une tendance naturelle à la mutation Multiplicité des cycles de réplication (1 à 10 milliards de particules /jour) + Grande variabilité au cours de la réplication = Variants génétiquement distincts provenant du virus initial contaminant (quasi-espèces)

42 Phénomène de résistance  Lié à des mutations entraînant une diminution de l’affinité de l’enzyme pour son inhibiteur  Préexistence des virus mutés chez les patients non traités  Variabilité génétique importante des VIH  taux d’erreur important de la RT lors de la réplication  dynamique élevée de la réplication virale  (10 9 particules/jour)  --> population existe sous forme de quasi- espèces  Emergence des virus mutés résistants sous la pression de sélection thérapeutique

43 Pression de sélection Sélection de variants résistants Suppression incomplète Charge virale Temps Variants sensibles Variants résistants Début du traitement V. Calvez

44 Mesure de la résistance  En routine, la mesure de la résistance est effectuée par la mise en évidence des mutations génétiques au niveau des sites d’action des médicaments   = Résistance Génotypique  Ce test de résistance est pratiqué chez les patients VIH traités et qui ont un échappement au traitement

45 Tests génotypiques Séquençage des gènes codant pour la RT,la protéase et l’intégrase : Pour les inhibiteurs de RT, Inhibiteurs de protéase, Inhibiteurs d’intégrase Séquençage du gène codant pour la gp 41 Pour les inhibiteurs de fusion Rétrotranscription de l'ARN viral PCR grâce à une enzyme thermostable 2ème PCR Séquençage du fragment PCR avec différent oligonucléotides Séparation des brins synthétisés par chromatographie Lecture de la séquence sur un séquenceur automatique

46 Séquenceur automatique

47 Lecture et interprétation des séquences

48 Tests génotypiques  Comparaison avec la séquence d’une souche de référence  non mutée  Mise en évidence des mutations connues pour être associées à la résistance à un médicament  Rendu des résultats pour chaque médicament grâce à des algorithmes d’interprétation des mutations  Ces algorithmes sont élaborés d’après les résultats des études cliniques (corrélations mutations/échec au médicament)  Adaptation du traitement anti-rétroviral en fonction des résistances

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