Les micro-ARNs : de la recherche fondamentale à la clinique en dix ans Laurent Metzinger INSERM ERI 12 / Affection minéralisante du système cardiovasculaire UFR de pharmacie d’Amiens, Université de Picardie Jules Verne. Dir. Pr. Z. Massy.

microARN : l’interférence par les petits ARN microARN (miARN ou miR) = petit ARN simple brin non codant de 21 à 25 nucléotides. Au minimum, 1 100 microARNs chez l’Homme. Régulent environ 30% des 25 000 gènes que comporte le génome humain. Différenciation / Prolifération Cancers, Désordres métaboliques, Maladies neurologiques…

Le dogme central Francis Crick : théorie du dogme central: La synthèse protéique à partir de l’information génétique : -Transcription -Traduction ARN messager ARN ribosomaux, de transfert ARN non codants siRNA SnRNA SnoRNA piwiRNA miRNA Interférence par l’ARN

La voie de l’interférence de l’ARN 1990 : Richard Jorgensen et al. intensification de la couleur des fleurs de pétunia. copie supplémentaire d'un gène impliqué dans la synthèse du pigment (l'anthocyanine). certaines plantes transgéniques produisaient des fleurs blanches !?! Gene silencing ou cosuppression.

Le concept d’ARN interférence Mécanisme d’inhibition génique très conservé au travers des espèces intervenant dans de nombreuses fonctions : la défense contre les virus la protection du génome contre les éléments transposables (ou transposons ) la régulation de l’expression des gènes : les microARNs.

Découverte des microARNs : Caenorhabditis elegans. 1993: Découverte de lin-4 chez C. elegans mutation du gène lin-14 qui n’est plus fonctionnel → Passage accéléré au stade L2 Isolation du gène lin-4 : régulateur de lin-14 lin-4 : ARN de 22nt complémentaire de l’ARNm de lin-14 en 3’UTR → empêche l’expression de lin-14 → régulation post-transcriptionnelle 2000: La découverte du petit ARN let-7 chez C. elegans: ARNnc de 21 nucléotides complémentaire à l’ARNm lin-41 homologues de let-7 chez protozoaires, plantes, champignons et animaux → mode de régulation ancien et important → 100, puis 250, puis 700, puis 1100 équivalents humains

Découverte des microARNs. 1990 Pétunia Phénomène de co-suppression 1993 Nématode C. elegans, lin-4 Régulation spécifique du développement des nématodes 2000 Nématode C. elegans, let-7 Généralisation du mode d’action de lin-4 2001 MicroARNs (miARN, miR) = petits ARNs régulateurs Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, Tuschl T. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science. 2001 Oct 26;294(5543):853-8. Lau NC, Lim LP, Weinstein EG, Bartel DP. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 2001 Oct 26;294(5543):858-62. Lee RC, Ambros V. An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science. 2001 Oct 26;294(5543):862-4. 2001 2011 fondamental clinique thérapie 7 7

Nomenclature On assigne aux microARNs confirmés expérimentallement un nombre associé au mir; ex : mir-143. mir- pre-miRNA miR- forme mature. miRNAs avec des structures similaires sauf un ou deux nucléotides : a,b… ex : miR-1a et miR-1b. Différents loci peuvent produire le même microARN mature : ex miR-1-1 and miR-1-2. Les miR provenant des extrémités 3’ ou 5’ du même mir dénommées avec un suffixe -3p et -5p ex : miR-142-5p, miR-142-3p Notion d’espèce : ex homo sapiens = hsa-miR-143. Mus musculus : mmu-miR-143 Plus… v-miR (virus), d-miR (drosophila ).

Biogénèse Rangrez et al., Circulation Cardiovascular Genetics in Press.

Identifiés chez C. elegans Formés de 21 à 25 nucléotides ARN monocaténaires repliés sur eux-mêmes en forme d’épingle à cheveux et codés par le génome Capables d’inhiber l’expression génique

2- Biogénèse a- Transcription b- Drosha c- Exportine 5 d- Dicer

a- Transcription Les gènes des miARN: ≈ 1 à 3% du génome Tous les chromosomes sauf Y Isolés ou regroupés → transcrit primaire « monocistronique » ou « polycistronique » Regroupés : fonctions proches Etape classique de transcription. Dans le noyau. ARNpol II Obtention du transcrit primaire pri-miARN → queue poly(A) en 3’UTR → coiffe 7MGpppG en 5’UTR

Pri-miARN est un transcrit primaire de grande taille (100 à 150 nucléotides), précurseur du futur miARN. Contient des répétitions quasi-complémentaires de nucléotides inversées→ se replie sur lui-même pour former une structure d’ARNdb en tête d’épingle.

B- Drosha Dans le noyau, le pri-miARN pris en charge par Drosha, RNase III de classe 2 Présente dans le microprocesseur, complexe multiprotéique en association avec Pasha (= DGCR8) Transforme le long pri-miARN en une structure plus petite en forme d’épingle à cheveux d’environ 70 nucléotides : le pré-miARN.

C- Exportine 5 Lie l’ARN dans le noyau et passe dans le cytoplasme sous forme d’un complexe trimérique Ran-GTP/Exportine 5 / ARNdb. L’ARNdb et Ran sont libérés suite à l’hydrolyse du GTP en GDP, et l’Exportine 5 retourne dans le noyau. L’énergie utilisée pour le transport est le gradient de Ran-GTP

Dans le cytoplasme, le pré-miARN est pris en charge par Dicer. RNase III de classe III. Reconnaît le pré-miARN et le clive→ formation d’un petit ARN d’environ 21 à 23 paires de bases (pb) possédant : - un groupement phosphate à l’extrémité 5’, - un groupement hydroxyle à l’extrémité 3’ et - 2 nucléotides non appariés à l’extrémité 3’. Cet intermédiaire de maturation est appelé miARN : miARN*. Il va être intégré dans le complexe effecteur stable appelé RISC (complexe ribonucléoprotéique, (RNA induced silencing complex). Seul un des brins du miARN :miARN* formera le miARN mature, généralement, le brin dont l’extrémité 5’ est la plus faiblement appariée. d- Dicer

Complémentarité imparfaite: le cas général Reconnaissance de l’ARNm : Liaison du miARN imparfaite→ zone de mésappariement. Inhibition post-transcriptionnelle → bloque la traduction de l’ARNm par le ribosome et la formation de protéines, ou dégradation de l’ARNm dans les p-bodies En 3’UTR de l’ARNm, parfois 5’UTR ou région codante Séquence seed : nt 2 à 8 en 5’UTR du miARN → Un miARN se lie à plusieurs ARNm → Un miARN se lie à plusieurs endroits en 3’UTR du même ARNm → Un ARNm lie plusieurs miARN → Classification des miARN en fonction de leur séquence seed

Ressources sur le Web : Prédiction de cibles : Tarbase http://microrna Ressources sur le Web : Prédiction de cibles : Tarbase http://microrna.gr/tarbase targetScan http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/cgi-bin/targets/v5/search.pl miRDB http://mirdb.org/miRDB/ MiRanda http://www.microrna.org/microrna/home.do miRbase http://www.mirbase.org/ … Polymorphisme des interactions (SNP) : Patrocles the database of polymorphic miRNA-target interactions. http://www.patrocles.org/

La régulation : who watches the Watchmen ? Les éponges à miARN : Plantes, virus, pseudogènes (ex. PTEN) Contact cellules-cellules : plus la densité cellulaire augmente, plus on a de microARNs (Mendell et al., PNAS, 2009) Protéines associées ? miR-143 et miR-145 : la myocardine. Rôle inédit de leurre (decoy) la protéine régulatrice hnRNPe2 lie l’ARNm codant CEBPA (CCAAT/enhancer-binding protein alpha, un facteur de transcription impliqué dans la régulation de la leptine) et l’inhibe. miR-328 peut se substituer à hnRNPe2 et activer indirectement l’expression de CEBPA. (Eiring et al., Cell, 2010)

Un exemple de mécanisme(s) d’action : l’influence des miR-143 et 145 sur la différentiation des cellules musculaires lisses. Rangrez et al., Circulation Cardiovascular Genetics in Press.

miR-143 et 145 : de nombreuses cibles. Rangrez et al., Circulation Cardiovascular Genetics in Press.

Méthodes d’études de la fonctionnalité des miARNS Puces dédiées type microarray RT-PCRq Pyro-séquençage massif (futur ?) Sous- et sur-expression 3’ 5’ Anti-miR miRNA Inhibitor 3’ 5’ Pre-miR miRNA precursor Hammond, Nature Methods pp694 - 695

TaqMan Array MicroRNA Cards

Principe de l’étude d’une maladie par analyse du RNome microARN -> ADNc Sous-classifications de maladie pour un traitement mieux ciblé Découverte de nouvelles cibles thérapeutiques Découverte de nouveaux marqueurs biologiques Signatures géniques ou Prédicteur pronostique Lemoine A. et Metzinger L.. Méthodes innovantes : de la génomique à la protéomique. In Biochimie Médicale Marqueurs actuels et perspectives. Durand G, Beaudeux JL, ed. médicales internationales/ Lavoisier. Nouvelle édition, en soumission, 2011.

Aspect prédictif : le génotypage du RNome des tissus pathologiques (patients insuffisants rénaux chroniques) aura une visée diagnostique potentielle. Aspect thérapeutique. Les microARN les plus dérégulés seront des cibles pour développer des traitements originaux dans le cadre des processus de calcification artérielle et/ou valvulaire.

Rôles des microARNs dans le processus cancéreux miARNs impliqués dans l’oncogénèse = oncoMirs miARNs suppresseurs de tumeurs

Rôles des microARNs dans le processus cancéreux : exemple du miR-21 Krichevsky, Gabriely J Cell Mol Med, 13, 39-53, 2009

Survival prediction of gastric cancer by a seven-microRNA signature Xiaohua Li, Ying Zhang, Yafei Zhang, Jie Ding, Kaichun Wu, Daiming Fan State Key Laboratory of Cancer Biology & Xijing Hospital of Digestive Diseases, The Fourth Military Medical University, Xi'an, China   MicroARNs et pronostic du cancer gastrique : signature de 7 microARNs étroitement corrélée à la survie des patients. Etude de l’expression du RNome de 100 patients par RT-PCR quantitative : identification d’une biosignature, non dépendante du stade cancéreux Signature : miR-10b, miR-21, miR-223, miR-338, let-7a, miR-30a-5p, miR-126 permet de diviser en deux groupes par rapport à la survie générale (p=0.0009) et à la survie sans apparition de récidive (p=0.0005). Cette signature pronostique peut être applicable à de futures décisions thérapeutiques. Gut 2010;59:579-585

Avancée technique récente : marqueurs biologiques non-invasifs miARNs détectés dans de nombreuses sources, y compris tissus pathologiques, mais aussi le sang et les fluides corporels (urine, salive) : présence stable, résultats reproductibles. Bonnes corrélations entre la concentration sérique et la quantité tissulaire dans plusieurs types de cancers. Potentiel en tant que marqueurs biologiques non-invasifs.

concentrations en ARN du sérum sont en moyenne de 100 ng/ml Les microRNAs stables dans le sérum stocké à 4 °C jusqu’à 4 jours, ainsi que durant de longues périodes à -20°C. concentrations en ARN du sérum sont en moyenne de 100 ng/ml La plupart des ARN du serum font moins de 33 nts, la plupart contenant 21–23 nts (deep sequencing methodology), donc enrichissement en microRNA du sérum Présence et stabilité des microARNs dans le sérum humain de deux volontaires sains. 18 microRNAs différents mesurés par RT-PCRq (+ 4 ARNs synthétiques ajoutés). Le même type d’étude a été mené sur l’urine des mêmes volontaires. Certaiins microARNs étaient indétectables, et les profils de l’urine étaient différents de ceux du sérum. (blue circles, cycle thresholds (CT) Serum microRNAs are promising novel biomarkers. Gilad et al., PLoS One. 2008 ; 3:e3148.

Comment ? les cellules cancéreuses sécrètent des microvésicules provenant de leur membrane appellées exosomes dans l’espace extra-callulaire qui peuvent ensuite être détectées dans le sang. Les exosomes : 30–100 nm de diamètre. Contenu : protéines, cytosol, mRNA, et microRNAs (absence d’ADN, d’ARN nucléaires, nucléolaires ou d’ARNr). Membrane lipidique : protection par rapport ribonucleases du sang. Relargage de miARNs après infarctus aigû du myocarde. Mécanismes possibles de relargage des miRNAs dans le sérum. Dimmeler,, Circ Res, 2010, 107:677-684

signature pronostique reposant sur 8 miARNs Figure 1. Profil des microARNs circulants dans des patients souffrant de troubles cardiovasculaires (n=8) vs contrôles sains (n=8). Les ARN  ont été isolés à partir de plasma-EDTA. (microarray). Figure 2.  microARNs circulants sélectionnés dans des patients souffrant de troubles cardiovasculaires (n=36) vs contrôles sains (n=17). Les ARNs  ont été isolés à partir de plasma-EDTA. (TaqMan PCR). signature pronostique reposant sur 8 miARNs

Les microARNs : cibles thérapeutiques originales : Exemple du cancer du poumon Délivrance exogène du miRNA let-7 dans les carcinomes non à petites cellules chez la souris diminution très significative de la masse tumorale Potentiel thérapeutique de let-7 dans le carcinome non à petites cellules. Thérapie de remplacement par miARN approche prometteuse dans le traitement du cancer. The let-7 microRNA reduces tumor growth in mouse models of lung cancer. Aurora Esquela-Kerscher et al., [Cell Cycle 7:6, 759-764; (2008)

Quelques perspectives Synthèse de microARN artificiels Insertion de microARN dans des nanoparticules lysosomiales introduites par voie intraveineuse → bloque jusqu’à 80 % des gènes ciblés → toxicité très basse par rapport à la thérapeutique conventionnelle Intervention de virus modifiés rendus capables de produire un microARN correspondant à un gène donné http://www.biocat.com/

Perspectives d’avenir en thérapeutique: Les éponges à ARN (RNA sponges) : transcrits sous le contrôle de promoteurs forts, contenant de multiples et répétés sites de liaison à un microARN d’intérêt. Utilisation de microARN artificiels Insertion de microARN dans des nanoparticules lysosomiales introduites par voie intraveineuse → bloque jusqu’à 80 % des gènes ciblés → toxicité très basse par rapport à la thérapeutique conventionnelle Pre-miR (miRNA precursor) Anti-miR (miRNA Inhibitor) Soaking up small RNAs  Scott M Hammond, Nature Methods pp694 - 695

November 5, 2011 Santaris Pharma A/S Phase 2a data of miravirsen shows dose-dependent, prolonged viral reduction of 2-3 logs HCV RNA after four-week treatment in Hepatitis C patients October 18, 2011 Servier and Miragen Sign $352 Million Partnership Agreement for the Research, Development and Commercialization of MicroRNA-targeting Drugs for Cardiovascular Disease

CONCLUSION Signature génique par les microARN Outil thérapeutique en développement (Sur- ou sous-régulation ) Mécanisme d’action. Protéines associées ?