Virologie Service de Virologie du CHU d’Amiens Pr Gilles Duverlie - gilles.duverlie@u-picardie.fr Unité de Virologie Clinique et Fondamentale (EA 4294 UPJV) S. Castelain, C. François, F. Helle, E. Brochot,... (n=11) Thématique principale « Virus, Hépatocytes & Foie » Unité de Virologie Médicale (CHU Hôpital Sud) C. Roussel, Dr C. Segard, P. Zawadzki,... (n=16) Génomique , Antigènes, Anticorps, Coordination Régionale & Interrégionale (G4-CHU, Internat) Biobanque de Picardie : (n=6) www.biobanque-picardie.com Enseignement : Pharmacie, Médecine, Sciences, Paramédical Doyen de la Faculté LS5-2 & MS1-1 (Infectiologie Moléculaire) Internat & DESBM, M1,M2, Thèses Le Service de Virologie du CHU d’Amiens comprend une Unité de Recherche à la Faculté (équipe d’accueil EA 4294) et un laboratoire de diagnostic virologique médical situé à l’Hôpital Sud du Centre Hospitalo-Universitaire qui regroupera à terme l’ensemble. Notre thématique de recherche concerne surtout le virus de l’Hépatite C avec une interface entre recherche clinique et recherche fondamentale sur les antiviraux et l’interféron, ainsi que la recherche d’anticorps pouvant neutraliser le VHC. La production du virus à visée vaccinologique est un autre défi lié à la difficulté de cultiver des hépatocytes primaires ou d’établir de nouvelles lignées permissives au VHC. L’ensemble de ces aspects conditionne en grande partie la mise au point un vaccin anti-VHC dont l’efficacité restera à démontrer. Le diagnostic virologique s’appuie de plus en plus sur les méthodes directes de détection des virus à l’aide des techniques de biologie moléculaire ou des techniques immunologiques. Cette activité concerne aussi le dépistage systématique (transfusion, greffe, bilan...) et dans certains cas le suivi thérapeutique . Les marqueurs pronostiques de l’évolution de l’infection se développent comme ceux de la réponse au traitement qui conditionnent en retour la conduite à tenir devant son indication et le choix du meilleur schéma thérapeutique. Nous enseignons dans toutes les composantes du Pôle Santé, et nous offrons la possibilité aux futurs pharmaciens de suivre l’UE optionnelle d’infectiologie moléculaire et thérapeutique en Master 1, puis en Master 2, et enfin de réaliser des travaux de recherche au travers d’une thèse d’université ou un mémoire pour la thèse d’exercice. Virologie

Evaluation & Contrôle continu Virologie Evaluation & Contrôle continu Evaluation de Type Internat QCM Dossiers Contrôle Continu : 3 évaluations Prise en compte des 2 meilleures notes + 0,5 prime par évaluation Livres de Virologie : cf BU Revues de Virologie : anglais, Virologie Nous utiliserons le contrôle continu pour l’évaluation des connaissances à l’aide de qcm et de dossiers cliniques et si possibles d’exercice. Ce type d’évaluation correspond au concours de l’internat ou les connaissances sont intégrées dans l’infectiologie (Bactériologie-Virologie- Parasitologie - Mycologie - Hygiène-Santé Publique) et plus largement dans la biologie clinique. Des logiciels peuvent être utilisés comme Hotpotatoes (gratuit avec inscription sur le web) pour s’entrainer et s’auto-évaluer . Virologie

Cours de VIROLOGIE Programme LMD : LS5-2 Définition / Classification / Réplication Epidémiologie / Pathogénèse / Diagnostic Herpesviridae : HSV, VZV, CMV, EBV, HHV-6 et -8 Adénovirus; Parvovirus et Papillomavirus (HPV) Picornaviridae; Rotavirus et virus des Gastroentérites Viroses respiratoires : Grippe et VRS Oreillons; Rougeole et Rubéole (ROR) Virus des Hépatites A à E Rétroviridae : HIV et HTLV Rage; Arboviroses et Fièvres Hémorragiques ATNC et Prions Le cours de Virologie comprend les généralités et les notions fondamentales nécessaires pour sa compréhension. Vient ensuite la Virologie Systématique avec un catalogue de plus en plus étendu de virus importants en Santé Publique. Nous donnerons leurs principales caractéristiques en insistant sur l’épidémiologie, les grands tableaux cliniques, le diagnostic, et enfin la thérapeutique ou la vaccination quand elles existent. Ceux qui veulent faire progresser la lutte contre les viroses devront à terme s’investir dans l’étude détaillée du cycle viral et de l’infection pour identifier des cibles potentielles et mettre au point des stratégies antivirales spécifiques et efficaces. Le pharmacien intéressé peut occuper une place de choix en interface entre la virologie clinique et fondamentale pour remplir une mission de Santé Publique. Virologie

GÉNÉRALITÉS SUR LES VIRUS Virologie Générale . DÉFINITION D ’UN VIRUS (après rappel historique) . CLASSIFICATION : Taxonomie virale . RÉPLICATION et MULTIPLICATION . EPIDÉMIOLOGIE . PATHOGÉNÈSE . INFECTION & IMMUNITÉ . DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE Voilà un plan de Virologie générale qui donne les grandes notions indispensables à la compréhension de toute infection virale Virologie

Feuille de plante malade Ultrafiltration < 0,22 Virologie UN PEU D ’HISTOIRE Expérience d ’Ivanofski (1890) Feuille de plante malade Plante saine Plante malade Bougie de porcelaine Ultrafiltration < 0,22 La cause de maladies autrefois très communes comme la rougeole et les oreillons est restée longtemps inconnue. L’hypothèse d’agents infectieux qui n’étaient ni des bactéries, ni des parasites a émergé au XIXème siècle. Vers 1890, le botaniste russe Dimitri Ivanovski étudia la mosaïque du tabac, et montra que les plantes malades contenaient un agent transmissible infectieux qui n’était pas retenu par les filtres de Chamberland. Le chimiste hollandais Martinus Beijerinck élimina l’hypothèse bactérienne et dénomma le phénomène « Contagium vivum fluidum ». Le biochimiste américain Wendell Stanley amènera une preuve définitive en cristallisant le virus de la mosaïque du tabac en 1935. C’est pendant la première Guerre Mondiale que l’anglais Frédéric Twort et le franco-canadien Félix d’Hérelle caractérisent des virus bactériophages capables de lyser les bactéries. L’idée de la phagothérapie revient à ce dernier. L’apparition de la microscopie électronique dans les années 1930 a permis l’observation des virus dont on put démontrer la composition en protéines et en acide nucléique. C’est vers 1960 qu’André Lwoff proposa une définition moderne des virus. Ensuite, les techniques de biologie moléculaire et cellulaire (culture virale) permettront de progresser dans le diagnostic virologique et l’élaboration de vaccins. Filtrat Infectieux en absence de bactéries Virologie

Vers une Définition des Virus Virologie Vers une Définition des Virus Virus, du latin poison, influence XIX ème : Agents infectieux filtrants < 0,22µ (virus ≈ 20 à 200 nm) Infectent tous les êtres vivants : bactéries : bactériophages animaux plantes : virus et viroïdes virus : virophages => Virus est un mot latin qui peut signifier poison ou influence. L’utilisation de filtres de Chamberland de porosité connue a permis de définir des agents infectieux filtrants différents des bactéries. La filtration à 0,22 micron est dénommée abusivement « filtration stérilisante » car cette porosité élimine la très grande majorité des bactéries, mais laisse passer les virus si ils sont présents. Les virus montrent une très grande diversité et peuvent infecter tous les êtres vivants, jusqu’au virus de virus ou virophages récemment identifiés à Marseille. Virologie

DEFINITION DES VIRUS Pas de Définition « officielle » ICTV Virologie DEFINITION DES VIRUS Pas de Définition « officielle » ICTV Un virus est une entité biologique qui nécessite une cellule hôte dont il utilise les constituants pour se multiplier www.ictvonline.org http://fr.wikipedia.org/wiki/Virus http://en.wikipedia.org/wiki/Virus Il n’y a pas de définition officielle des virus par le Comité International de Taxonomie Virale (ICTV - www.ictvonline.org ). Ils représentent un continuum entre le monde inerte (assemblage de molécules) et le monde classique du vivant par leur cycle de multiplication cellulaire. Quelques virus peuvent s’assembler « in vitro » comme des bactériophages. Par ailleurs, certains éléments mobiles de notre génome ont des comportements très proches de certains virus (rétrotransposons). Les virus de définissent d’abord par leur parasitisme cellulaire pour se multiplier ainsi que par certaines caractéristiques présentées dans la diapo suivante : un seul acide nucléique : ADN ou ARN multiplication aux dépens de la cellule sans croissance, division ou scissiparité. Le virion correspond à la forme infectieuse mature et inerte Virologie

Paroles de Virus Je suis le Parasite Absolu, Ne Vivant qu’en Cellule Virologie Paroles de Virus Je suis le Parasite Absolu, Ne Vivant qu’en Cellule où mon Unique Acide Multiplie les Messages de ma Libération Spire ou Cristal Enveloppant parfois Mon Core dans ses Voiles (To be or not to be ?) Virologie

« Définition » des virus (Lwoff) Virologie « Définition » des virus (Lwoff) VIRUS = Parasite Absolu, sans Système Energétique Intracellulaire se Effet Antiviral souvent Cytotoxique Réplicant à partir d' Multiplication par la cellule hôte: ni croissance ou division, mitose ou scissiparité. Un Acide Nucléïque en une Un et un seul : Le génome viral Structure infectieuse, Le VIRION Forme mature extracellulaire (inerte, petite (environ 100nm) Un virus peut donc être reconnu comme un parasite intracellulaire se réplicant à partir de son génome composé d’un seul type d’acide nucléique (ADN ou ARN) et s’assemblant avec ses protéines (d’information génétique virale) pour former un virion, c’est à dire une particule infectieuse mature libérée dans le milieu extracellulaire. Par conséquent, les virus sont des parasites absolus, sans aucun système énergétique. De ce fait, les premières molécules antivirales ont été dérivés des anticancéreux et leur activité était souvent liée en partie à leur effet cytotoxique. Les virus utilisant la machinerie cellulaire pour se multiplier sans phase de croissance ou de division, sans mitose ou scissiparité. Ils apparaissent dans la cellule après une phase d’assemblage de leur génome et de leurs protéines. Les virions sont enfin libérés des cellules et représentent la forme extracellulaire infectieuse des virus (taille 100 nm). Virologie

DÉFINITION des VIRUS (suite) Virologie DÉFINITION des VIRUS (suite) Agents sous-viraux: nécessitent un virus auxiliaire Agent delta: co-infection avec le virus de l ’hépatite B Viroïdes : végétaux seulement? petites molécules d ’ARN circulaires nus ATNC (Prions): Agents Transmissibles Non Conventionnels Protéine endogène PrP modifiée infectieuse D’autres agents ou formes virales méritent d’être commentées ou définies. Les agents sous-viraux comprennent des satellites de virus nécessitant un virus auxiliaire pour se multiplier (helper). Les viroïdes sont aussi des agents sous-viraux constitués uniquement d’acide nucléïque alors que les prions ne seraient constitués que de protéines.... Le provirus correspond à l’état intégré du génome viral dans celui de la celule hôte eucaryote ou procaryote. Dans ce derniier cas, on parle de prophage. Ils faut noter que de nombreuses toxines bactériennes sont en fait codées par des prophages intégrés dans le génome bactérien. La position épisomale du génome viral correspond à une situation extrachromosomique du génome comme un plasmide dans une bactérie. Enfin, les réplicons correspondent à des structures capables de réplication autonome. Ces structures sont souvent construites par génie génétique pour définir le complexe de réplication du virus et insérer éventuellement des transgènes dans son génome... Virologie

Terminologie virologique Provirus ≈ virus intégré dans le génome intrachromosomique : ADN proviral des rétrovirus Prophage des bactériophages (scarlatine, diphtérie, etc…) Episome = génome viral intracellulaire (latence) extrachromosomique virus herpétiques (EBV), papillomavirus (HPV) Réplicon = structure de réplication autonome Virus défectifs = virions non cultivables ADN ou cDNA infectieux électroporation d’ADN ou d’ARN => virus infectieux Génétique synthétique : synthèse d’ADN ou de cDNA infectieux

Origine & Evolution des virus Virologie Origine & Evolution des virus Origine hypothétique: (pas de virus fossiles) Apparition avant ou pendant la génèse cellulaire Evolution rétrograde à partir d ’autres organismes Evolution pluriphylétique: Virus ARN ; virus ADN ; Rétrovirus Potentiel évolutif important Temps de génération court & nombreux virions produits Taux élevé de mutations (polymérases virales) Quasi-espèce viral = Variants apparentés Problèmes diagnostiques (génomes & antigènes) Problèmes thérapeutiques (résistance) Problèmes vaccinaux (échappement) L’origine des virus est très discutée avec l’absence de virus fossiles identifiables. L’ensemble des virus dériverait de plusieurs phylums différents. Leur apparition aurait pu avoir lieu avant ou en parallèlle de la génèse cellulaire, car certains virus comprennent de l’ARN qui serait la molécule primitive de la vie (molécule informative avec des capacités de réplication et des capacités enzymatiques comme les ribozymes). D’autres hypothèses concordent avec une évolution rétrograde des virus à partir de cellules... Tous les virus, surtout les virus à ARN avec des polymérases dont le taux de mutation généré au cours de la réplication est très élevé, ont une variabilité génétique très importante. Un individu infecté héberge en fait une population virale très diverse mais apparentée, dénommée sous le terme de quasi-espèce ou quasispecies. Ce quasispecies confère aux virus une grande plasticité génomique expliquant les problèmes d’échappement aux antiviraux ou aux vaccins, ainsi que des problèmes diagnostiques où certains variants ne sont pas reconnus par les anticorps utilisés, ou encore par les amorces ou les sondes génomiques ou subgénomiques. Virologie

SCHÉMA D’UN VIRUS ARN ou ADN + protéines  enveloppe Virologie SCHÉMA D’UN VIRUS ARN ou ADN + protéines  enveloppe ARN ADN Protéines Beaucoup de virus sont dits nus, et ne sont composés que de leur génome protégé par une capside protéique codée par le génome viral. Certains virus bourgeonnent au travers des membranes cellulaires qui peuvent alors les envelopper. Ils possèdent alors une membrane phospholipidique d’origine cellulaire où sont souvent enchassées des protéines virales appelées péplomères. Les péplomères sont souvent glycosylés dans le réticulum endoplasmique et sont donc composés de glycoprotéines. Certains de ces péplomères peuvent correspondre aux protéines d’attachement des virus sur leurs récepteurs, et peuvent susciter la formation d’anticorps neutralisants qui peuvent protéger de l’infection (anticorps protecteurs). Ils représentent donc alors des candidats vaccins de choix à eux seuls (antigène HBs) ou en association à d’autres protéines virales. Protéines d’enveloppe Enveloppe Virologie

STRUCTURE DES VIRUS Unité structurale : 2 éléments constants Virologie STRUCTURE DES VIRUS Unité structurale : 2 éléments constants Génome: ARN ou ADN sous toutes leurs formes, monocaténaire ou bicaténaire, linéaire ou circularisé Petit ≈ 3 à 300kb (génomes et cDNA infectieux) Compactage : Polyprotéine, Phases de lecture, Épissage Capside: Hélicoïdale, Tubulaire ou Icosaédrique Capacité de codage limitée Assemblage symétrique Capsomères+ Génome  NUCLÉOCAPSIDE Enveloppe (fragilité, transport) Protéines enzymatiques (impliquées dans la réplication) Les virus présentent des génomes de petite taille et donc d’information génétique assez limité (3 à 300kb) si l’on compare à notre génome haploïde composé de 3 milliards de paires de base qui constituent nos 23 chromosomes. Malgré leur petite taille, ils possèdent souvent des génomes très compacts jouant sur toutes les formes de codage en utilisant les trois phases de lecture des ARNs messagers et aussi l’épissage, etc... Cette capacité limitée de codage implique des capsides composées de peu de protéines qui forment volontiers des formes symétriques. Les symétries les plus classiques sont les symétries cubiques ou hélicoïdale. La symétrie cubique correspond souvent à une forme pseudo-sphérique dont le polyèdre régulier le plus proche est l’icosaèdre (20 faces triangulaires et 12 sommets ). Certains ballons de foot-ball sont des icosaèdres. La symétrie hélicoïdale correspond à une hélice droite ou gauche, avec un pas, un diamètre interne et externe. La capside est formés d’unités macromoléculaires identiques appelés capsomères qui forment une nucléocapside avec le génome à l’intérieur. A côté des protéines structurales (protéines du virion) peuvent être présentes certaines enzymes indispensables à la réplication intracellulaire du virus (polymérases) ou quelquefois à son infectiosité (neuraminidase). L’enveloppe virale est souvent fragile, en particulier vis à vis des solvants lipidiques. La transmission des virus enveloppés se fait souvent par contact rapproché. Virologie

ADN ARN GÉNOMES VIRAUX ADN/1 Simple brin : Parvovirus Virologie ADN ARN GÉNOMES VIRAUX ADN/1 Simple brin : Parvovirus + Picornavirus ou - Paramyxovirus ADN/2 Double brin : Adénovirus Segmenté : Orthomyxovirus Circulaire : Papovavirus ARN/2 Segmenté : Rotavirus ARN/1 circulaire : agent delta Virologie

HÉLICOÏDALE ICOSAÉDRIQUE Virologie CAPSIDE HÉLICOÏDALE ICOSAÉDRIQUE Virologie

FONCTIONS DE LA CAPSIDE Virologie FONCTIONS DE LA CAPSIDE Protection du génome Transport intercellulaire Spécificité d’attachement Virologie

CAPSIDE ICOSAÉDRIQUE Penton Capsomère Hexon Capsomère Virologie CAPSIDE ICOSAÉDRIQUE Penton Capsomère Constitué de 5 sous-unités; sommets Hexon Capsomère Constitué de 6 sous-unités Virologie

Nucléocapside hélicoïdale enveloppée Virologie Nucléocapside hélicoïdale enveloppée Péplomères Spicules Capsomères (Glycoprotéines) (Protéine) Acide nucléïque Enveloppe (Protéines & Lipides) Enzymes Virologie

ENVELOPPE VIRALE ou PEPLOS Virologie ENVELOPPE VIRALE ou PEPLOS Peplos = manteau en grec dérivée des membranes cellulaires Constituée d ’une bicouche lipidique et de protéines virales glycosylées ou non  PÉPLOMÈRES Acquisition de l ’enveloppe au cours de la dernière phase de l’assemblage Virologie

ENVELOPPE VIRALE ou PEPLOS Virologie ENVELOPPE VIRALE ou PEPLOS Sensibilité aux solvants = virus + fragile Dégradation dans le milieu extérieur ou digestif Chaleur; Dessication, … Dégradation par la barrière digestive Protéines de l ’enveloppe: propriétés différentes Protéines d’attachement, Hémagglutinines Antigènes : Vaccin, Ac Neutralisants protecteurs Virologie

VIRUS ENVELOPPÉS MEMBRANE Spicules protéiques capside Virologie

CLASSIFICATION DES VIRUS Lwoff, Horne et Tournier, 1962 Virologie CLASSIFICATION DES VIRUS Lwoff, Horne et Tournier, 1962 Acide Nucléïque - ADN ou ARN double ou simple brin, circulaire ou fragmenté ARN messager(+) ou non(-) (stratégie de réplication) Nucléocapside - Symétrie Hélicoïdale : pas, Ø interne et externe Cubique : Nombre de capsomères Enveloppe - origine cellulaire (fragilité) - Péplomères Virologie

CLASSIFICATION DES VIRUS Virologie CLASSIFICATION DES VIRUS TAXONOMIE et Terminologie (suffixe): Famille: -viridae ex: Herpesviridae Sous-famille: -virinae ex: Herpesvirinae Genre et espèce: -virus ex: Herpesvirus PHYLOGÉNIE DES VIRUS: Différenciation entre types, entre sous-types Distances phylogénétiques et homologie: Arbre phylogénétique QUASIESPECE: Ensemble de clones constituant l ’isolat viral Complexité et Diversité Virologie

Virus à ADN ICOSAÉDRIQUE COMPLEXE ENV. NON-ENV. ENV. Double brin Virologie Virus à ADN ICOSAÉDRIQUE COMPLEXE ENV. NON-ENV. ENV. Double brin Simple brin Double brin Double brin HERPESVIRIDAE HEPADNAVIRIDAE PARVOVIRIDAE PAPOVAVIRIDAE ADENOVIRIDAE POXVIRIDAE Virologie

Virus à ARN ICOSAÉDRIQUE HÉLICOÏDAL ENV. ENV. NON-ENV. Simple brin Virologie Virus à ARN ICOSAÉDRIQUE HÉLICOÏDAL ENV. NON-ENV. ENV. Simple brin Simple brin Double brin Simple brin TOGAVIRIDAE FLAVIVIRIDAE PICORNAVIRIDAE CALICIVIRIDAE REOVIRIDAE RHABDOVIRIDAE PARAMYXOVIRIDAE BUNYAVIRIDAE ARENAVIRIDAE ORTHOMYXOVIRIDAE CORONAVIRIDAE Virologie

VIRUS à ADN PARVOVIRIDAE PAPOVAVIRIDAE ADENOVIRIDAE HERPESVIRIDAE Virologie VIRUS à ADN PARVOVIRIDAE PAPOVAVIRIDAE ADENOVIRIDAE HERPESVIRIDAE HEPADNAVIRIDAE POXVIRIDAE Virologie

VIRUS à ARN TOGAVIRIDAE FLAVIVIRIDAE BUNYAVIRIDAE REOVIRIDAE Virologie VIRUS à ARN TOGAVIRIDAE FLAVIVIRIDAE BUNYAVIRIDAE REOVIRIDAE PICORNAVIRIDAE RHABDOVIRIDAE ARENAVIRIDAE CORONAVIRIDAE PARAMYXOVIRIDAE ORTHOMYXOVIRIDAE RETROVIRIDAE Virologie