Métrologie en cytogénétique STRASBOURG, septembre 2015 Alain DAUNIZEAU A.T.C. Association des Techniciens en Cytogénétique Métrologie en cytogénétique STRASBOURG, septembre 2015 Alain DAUNIZEAU A. Daunizeau - Septembre 2015

Matériel de laboratoire Equipements Instruments, automates, instruments de mesure, Enceintes thermiques, biologie délocalisée SIL, logiciels Réactifs et consommables Réactifs, Matériaux de référence, d’étalonnage, de contrôle Matériels de prélèvement, Milieux de culture, Petit matériel A. Daunizeau - Septembre 2015

Processus de maîtrise des équipements Phase d’acquisition Objectif : choix d’un matériel adapté aux besoins, EEQ Méthode : définir les besoins, puis les critères de choix Phase d’installation Objectif : vérification des performances à l’installation Méthode : métrologie, validation de méthode Phase d’utilisation Objectif : maintien des performances, CIQ Méthode : respect des modes opératoires, protocoles d’étalonnage, de maintenance, de contrôles

Schéma du processus Installation Etalonnage Utilisation Besoins Achat Vérification OK ? Eqpt critique ? Mise en service Métrologie Etalonnage Utilisation Non Oui Oui Non

Schéma du processus Métrologie ? Métrologie Utilisation Maintenance OK ? Maintenance Maintenance ? Métrologie ? Métrologie Perf. maintenues ? Panne ? Résultats Solution de secours Conformes ? Réforme Oui Non Oui Non Oui Non Non Non Oui Oui Oui Non

Définitions Métrologie : science de la mesure Appareil de mesure : dispositif destiné à faire un mesurage, seul ou en conjonction avec d’autres équipements. Mesure matérialisée : dispositif destiné à reproduire ou à fournir de façon permanente pendant son emploi, une ou plusieurs valeurs connues d’une grandeur donnée. Instrument de mesure : ce terme recouvre les deux définitions précédentes.

Définitions Etalonnage : opération qui, dans des conditions spécifiées, établit : en une première étape une relation entre les valeurs et les incertitudes de mesure associées qui sont fournies par des étalons et les indications correspondantes avec les incertitudes associées, puis utilise en une seconde étape cette information pour établir une relation permettant d’obtenir un résultat de mesure à partir d’une indication. Ajustage : ensemble d'opérations réalisées sur un système de mesure pour qu'il fournisse des indications prescrites correspondant à des valeurs données des grandeurs à mesurer.

Définitions Raccordement métrologique : comparaison d’un instrument de mesure à une valeur de référence délivrée par un étalon ou un matériau de référence, ou encore un autre équipement étalonné. Traçabilité métrologique : Propriété d'un résultat de mesure selon laquelle ce résultat peut être relié à une référence par l'intermédiaire d'une chaîne ininterrompue et documentée d'étalonnages dont chacun contribue à l'incertitude de mesure. Confirmation métrologique : ensemble d'opérations nécessaires pour assurer qu'un équipement de mesure répond aux exigences correspondant à l'utilisation prévue. Vérification métrologique : consiste à apporter la preuve à partir de mesures (étalonnage) que des exigences spécifiées (les EMT) sont satisfaites.

Instrument de mesure Em Vref Vm température -Ue +Ue A tout instrument de mesure est associée : - une erreur de justesse - une imprécision Exemple : thermomètre Em Vref Vm température -Ue +Ue Vref : valeur de référence Vm : valeur mesurée Em : erreur de mesure | Em | : valeur absolue de Em Ue : incertitude de mesure de l’instrument

EMT : erreur maximale tolérée Définition (guide ISO/CEI 99, article 4.26) « Erreur maximale tolérée : limite d'erreur ou valeur extrême de l'erreur de mesure, par rapport à une valeur de référence connue, qui est tolérée par les spécifications ou règlements pour un mesurage, un instrument de mesure ou un système de mesure donné. »

EMT : erreur maximale tolérée L’EMT peut être définie de différentes façons : - voie réglementaire ; c’est le cas pour la métrologie légale (par ex. pompes à carburant, balances commerciales ou pour utilisation médicale, etc.)  - voie normative ; normes d’étalonnage des pipettes, des balances,… - le fabricant de l’instrument  - l’utilisateur qui, en fonction de ses propres besoins, est le mieux à même de définir le niveau d’erreur maximale pour chacun de ses équipements. Exemple : NF EN ISO 8655-2 Pipettes dont le volume nominal est situé entre 50 et 100 μl, la norme fixe une EMT de 0,8 μl soit, pour un volume de 100 μl, ± 0,8 %.

EMT : erreur maximale tolérée - EMT Vref Vm +EMT -Ue +Ue Vref : valeur de référence Vm : valeur mesurée Em : erreur de mesure | Em | : valeur absolue de Em Ue : incertitude de mesure de l’instrument | Em |  + Ue ≤ EMT La connaissance des performances de l’instrument permet de définir des limites d’alarme

Exigences techniques 2°C 8°C - EMT Vm +EMT Exemple : maintenir les réactifs entre 2° et 8°C 2°C 8°C - EMT Vm +EMT Objectif : disposer d’un thermomètre permettant de garantir que les réactifs sont toujours entre 2° et 8°C Pour les enceintes thermiques, le document du Cofrac SH GTA 01 propose de définir l’EMT comme le quart de la tolérance associée au besoin.

EMT et limites d’utilisation Exemple Thermomètre T : -20° à +80°C, ± 0,4°C Etalonnage à 4°C : Vm = 4,2°C ± 0,4°C Erreur +0,2 Etalonnage à 37°C : Vm = 37,3 °C ± 0,3°C Erreur +0,3 EMT ≥ 0,7 Application au suivi d’un réfrigérateur Objectif : entre 2 et 8°C Tolérance associée au besoin : ± 3°C EMT < ¼ de la tolérance : le thermomètre peut être utilisé Suivi d’une étuve de microbiologie Objectif : 37 ± 1°C Tolérance associée au besoin : ± 1°C EMT > ¼ de la tolérance : le thermomètre n’est pas adapté au besoin

Métrologie des instruments du LBM Instruments critiques Confirmation métrologique : ne s’applique qu’aux instruments dits critiques (ont une incidence significative sur l’exactitude et la fiabilité des résultats) Equipements pouvant être concernés - instruments simples de mesure de : - volumes : pipettes et autres contenants volumétriques, appareils à pistons - masses : balances, - températures : thermomètres ; - équipements autres dont les performances peuvent avoir un effet sur la qualité des résultats : enceintes thermiques, bains-marie, thermocycleurs, centrifugeuses, zones de stockage, etc. - analyseurs intégrant dans leur structure des instruments de mesure : analyseurs multiparamétriques, pH-mètres, osmomètres, etc. ;

Métrologie des instruments du LBM Equipements critiques Equipements ayant une incidence significative sur l'exactitude et la fiabilité des résultats - instruments de mesure directe (spectrophotomètre, pH-mètre, …) - instruments impliqués dans le processus analytique balances utilisées pour préparer un réactif, pipettes pour préparer un échantillon de contrôle, étuve intervenant dans une incubation, etc. Le LBM doit identifier : - ses équipements critiques - les grandeurs mesurées correspondantes - les exigences métrologiques spécifiées (tolérances et plages d’utilisation) - les types de raccordement métrologique employés. A. Daunizeau - Paris, 15 mai 2014

Etalonnage Comparaison - avec un instrument étalon - avec les résultats de la mesure d’une étalon Permet de connaître l’erreur de justesse d’un instrument écart entre la valeur lue et la valeur de référence donnée à partir de l’étalon. Application instrument ajustable : modification jusqu’à erreur = 0 instrument non ajustable : corriger les résultats de mesure Correction = - Erreur Exemple Thermomètre T : 20,2°C, thermomètre étalon : 20,0°C erreur : +0,2°C donc correction : - 0,2°C Si température mesurée 18,5°C, alors température réelle : 18,3°C

Vérification métrologique Vérification d’un instrument après chaque opération susceptible de modifier ses caractéristiques Comparaison à la référence Calcul de l’erreur totale | Em |  + Ue Comparaison à l’EMT Conduite à tenir ajustage, réparation, déclassement, réforme

Confirmation métrologique Objectif : s’assurer que l’erreur totale liée à tout mesurage, représentée par la somme de l’erreur de mesure et de l’incertitude de l’instrument est inférieure à une limite acceptable : EMT Etalonnage Vérification Réglages ou réparations éventuelles Réétalonnage si nécessaire Comparaison avec les exigences métrologiques pour l’utilisation prévue Verrouillage Etiquetage L’étalonnage permet de connaître la valeur de l’erreur de mesure. La vérification permet de s’assurer que l’erreur totale est inférieure à l’EMT A. Daunizeau - Paris, 15 mai 2014

Confirmation métrologique Comparaison avec un étalon Vérification Etalonnage OUI Conforme NON Ajustage Réparation Déclassement Réforme Constat de vérification Constat d’étalonnage Confirmation métrologique = étalonnage + vérification Mise ou remise en service

Mise en œuvre au laboratoire Désignation d’un responsable métrologique personne qui a la responsabilité administrative et technique de définir et de mettre en œuvre le système de management de la mesure - Inventaire des équipements - Acquisition : réception des matériels - Entretien : opérations de maintenance - Programmes d’étalonnage et de vérification raccordement métrologique : choix des étalons, traçabilité raccordement aux chaînes d’étalonnage raccordement analytique - Gestion documentaire spécifique

Le responsable métrologie Cette personne doit avoir fait l’objet d’une qualification et d’une habilitation spécifiques. Pour exercer convenablement sa mission, il est recommandé que le responsable métrologie possède quelques qualités particulières telles que : • expérience du laboratoire et de ses équipements, • bonne connaissance des instruments et des analyses, • formations approfondies sur les automates, • rigueur et méthode, • capacité d’observation et sens critique. A. Daunizeau - Paris, 15 mai 2014

Missions du métrologue (1) Gestion des équipements Participer à la définition des objectifs en matière de métrologie, raccordement, fréquence, modalités et programme d’étalonnage Organiser la gestion des équipements : qualification des instruments, sous-traitance éventuelle, inventaire, maintenance et bon fonctionnement Evaluer les besoins réels en moyens de mesure et orienter la gestion de ces moyens Maîtriser l’aptitude à l’emploi de tous les moyens de mesure Veille technologique Gestion des processus de mesure Assurer la gestion des moyens de mesure : analyse des besoins, choix, mise en service et le suivi Activer le processus de confirmation métrologique et en surveiller le fonctionnement Assurer la mise en œuvre des conclusions

Missions du métrologue (2) Gestion des compétences Répartir les activités entre les divers participants Préciser les attributions confiées et la compétence nécessaire Vérifier que chaque participant est conscient de l’étendue et des limites de sa sphère de responsabilité Prévoir et valider les formations adaptées Tenir à jour des qualifications, formations, et expérience. Participer à la formation du personnel utilisateur des instruments de mesure Gestion de la documentation Valider et gérer la documentation spécifique Assurer l’exploitation des données des certificats d’étalonnage et de vérification

Organisation pratique Réalisation de l’étalonnage Dans tous les cas, produire un certificat d ’étalonnage Si fait au LBM : - locaux adaptés : surveillance de la température, de l’hygrométrie, de la pression atmosphérique - disposer de tous les protocoles d’étalonnage nécessaires Sous-traitance - en tout ou en partie (politique et objectifs) - rôle du LBM (responsable métrologie) planifier et organiser la sous-traitance s’assurer de la réalisation des opérations conserver les documents de preuve, certificats et constats enregistrer les diverses opérations évaluer les fournisseurs A. Daunizeau - Paris, 15 mai 2014

Raccordement métrologique Afin d’assurer le raccordement au système International d’Unités (SI), le laboratoire peut : Réaliser le raccordement en externe : par un laboratoire d’étalonnage accrédité (COFRAC ou équivalent)  la preuve du raccordement est le certificat ou le constat portant le logotype Cofrac Réaliser le raccordement en interne  La preuve du raccordement est le rapport émis par le LBM (pas de logo Cofrac) et le certificat de l’étalon utilisé portant le logotype COFRAC. Les aspects techniques sont évalués selon les exigences de l’ISO 17025 :  rédaction des procédures d’étalonnage  formation/habilitation du personnel  estimation des incertitudes d’étalonnage A. Daunizeau - Paris, 15 mai 2014

Mesure de volumes Pipettes Reconstitution de contrôles et étalons pipettes en verre à 2 traits de classe A Demander un certificat au fournisseur Vérifier régulièrement leur bon état : ébréchures, bouchage, lavage (sans détergent) Respecter les conditions d’utilisation : liquides à la température d’étalonnage tenue verticale à hauteur d’œil lecture tangentielle du bas du ménisque stockage à l’abri des chocs NB Pas de pipette à piston de 1000 µL pour prélever 5 mL d’eau distillée ! Erreur × 5 Incertitude × 2

Mesure des volumes Verrerie volumétrique Examen préliminaire : traits de graduation, état des matériels Utilisation Verrerie tenue verticalement Extrémité des pipettes contre la paroi des récipients Creux du ménisque à hauteur des yeux Mesure des volumes à température proche de 20°C Liquides portés à cette température Nettoyage non agressif (neutre ou légèrement alcalin) A température inférieure à 60°C A. Daunizeau - Paris, 15 mai 2014

Mode opératoire des essais par gravimétrie (ISO 8655-6, 7.1.2) Mesure des volumes Pipettes Mode opératoire des essais par gravimétrie (ISO 8655-6, 7.1.2) - Température constante (± 0,5°C) entre 15 °C et 30 °C - Humidité relative > 50 % - Equilibre de l’instrument et de l’eau au moins 2 heures à T ambiante - Piège à évaporation pour des volumes < 50 µL - Durée de pesée < 60 sec (évaporation) - Au moins 3 volumes d’essai pour les appareils à volume variable : volume nominal, 50 % de ce volume, 10 % de ce volume - 10 mesures pour chaque volume - Enregistrement de température (à 0,2°C près) de la pression (à 1 kPa près) - Calculs et rapport d’essai A. Daunizeau - Paris, 15 mai 2014

Mesure de volumes Pipettes à piston > 100 µL < 100 µL étalonnage possible au LBM avec balance de précision étalonnée (1/10 mg) NF EN ISO 8655-6 : 2002 - Partie 6 : méthodes gravimétriques pour la détermination de l’erreur de mesure et - Partie 2 : pipettes à piston. Le LBM doit alors rédiger un certificat d’étalonnage comportant les mentions réglementaires . < 100 µL étalonnage par un organisme certifié vérifier les conditions de transport Toutes pipettes Vérification régulière (erreur < EMT) Respect des conditions d’utilisation Tous appareils volumétriques certifiés identification particulière (éviter des confusions)

Maîtrise des températures Cartographie des enceintes thermiques Objectif : - déterminer les caractéristiques de l’enceinte (homogénéité) - connaître et / ou s’assurer périodiquement des performances réelles de l’enceinte. (A faire tous les 5 ans)  Norme de référence : NF X 15-140 Relevé des températures Objectif :  - garantir des conditions de fonctionnement conforme vérification quotidienne enregistrement A. Daunizeau - Paris, 15 mai 2014

Mesure des températures Caractérisation des enceintes thermiques: mesure des températures en 9 points : volume < 2m3 en 15 points : volume > 2m3 au minimum 30 mesures pendant au moins 30 minutes l’intervalle entre chaque mesure est de 1 min maximum

Caractérisation d’une enceinte thermique Relevé des températures : toutes les sondes affichent des températures comprises entre les valeurs limites définies par le laboratoire (ici entre 3°C et 7°C), l’enceinte est déclarée conforme et peut être utilisée. °C 8 7 6 5 4 3 2 limite Cible 1 2 3 4 5 6 7 8 9 n° sonde

Caractérisation d’une enceinte thermique

Enceintes thermiques Relevé des températures Vérification quotidienne, Limites d’alerte, limites d’alarme, enregistrement Ne pas oublier les zones de stockage Que faire en cas de dépassement des limites de température ? - Tracer le dépassement - Rechercher et expliquer la cause (chargement de nouveaux réactifs, portes restée ouverte, panne, coupure de courant, …) - Tracer les produits impactés et être vigilent lors de leur prochaines utilisations - Mise en place d’actions correctives

Cas des thermocycleurs Plusieurs types d’appareils - Appareil à tubes fixes. La plaque à puits est alternativement chauffée par des résistances électriques et refroidie par un dispositif à compresseur ou à effet Peltier. - Appareil à tubes mobiles. L’appareil est constitué de plusieurs plaques à puits à température fixe et régulée. Les tubes sont déplacés par un bras qui les transporte de plaque en plaque pour changer leur température. Vérification de : - La correspondance entre la température en un point central de la plaque et la température programmée. - L’homogénéité de la température sur tous les puits de la plaque. - La durée des plateaux de température. - Gradient thermique

Vérification des thermocycleurs Après nettoyage, - enregistreur de températures spécifique - protocole établi par les constructeurs. Précision souhaitée (en général) ± 0,75°C pour la température ± 0,5s pour les temps. Vérification des gradients - sonde sans inertie thermique - tube identique à ceux utilisés dans les PCR - rempli de la même quantité du même liquide Certificat de vérification conformité du thermocycleur par rapport aux limites données par le constructeur.

Contrôle des températures Disposer d’un thermomètre de référence - Conforme : aux normes en vigueur - Certifié : étalonnage officiel établi par un laboratoire agréé (BNM, LNE) - Étalonné : étalonnage raccordé conforme à la norme ISO 9000 - Incertitudes calculées et connues raccordement aux chaînes internationales d’étalonnage (BNM,/ COFRAC) Quel thermomètre ? Numérique, -25°C à 120°C Incertitude ± 0,2°C, résolution 0,1 °C Capteur pour ambiance et immersion Sonde platine avec câble flexible (1,5m) Connexion possible à une imprimante ou un PC Étalonné et certifié COFRAC à -20°C, 5°C, 37°C A. Daunizeau - Paris, 15 mai 2014

Dépassement de température Procédure - Tracer le dépassement - Informer la personne responsable (contractualisation éventuelle) - Rechercher et expliquer la cause (chargement de nouveaux réactifs, portes restée ouverte, panne, coupure de courant, …) - Tracer les produits impactés et être vigilent lors de leur prochaine utilisation - Si répétition du problème, mettre en place des actions correctives - Solution de secours L’existence d’une centrale de télésurveillance des températures ne dispense pas du relevé quotidien A. Daunizeau - Paris, 15 mai 2014

Centrifugeuses Centrifugeuse considérée comme critique raccorder la vitesse de rotation (et au besoin la température et la mesure du temps aux unités SI) Vitesse - en interne si le LBM dispose d’un tachymètre raccordé - sous-traiter (prestataire externe) demander le certificat d’étalonnage du tachymètre et des autres instruments utilisés, et vérifier qu’ils sont raccordés. Rappel : FCR = (V / 1000)2 × R × 1,118 FCR : Force de centrifugation relative (en nombre de g) ; V : vitesse de rotation du rotor (en tours /minute) ; R : rayon de giration (en mm) ; Ex. : pour un rayon de 100 mm, et à une vitesse de 4000 t/mn, l’accélération est de 1800 g

Mesure des masses Balance de précision Recommandé : étalonnage par un organisme certifié, qui peut de plus assurer un ajustage ou une réparation Etalonnage au LBM s’il dispose de masses étalons raccordées, et en respectant les exigences de la norme spécifique Vérification métrologique régulière de la balance - mesure de masses étalons, avant chaque pesée ou régulièrement en fonction des besoins. - masses étalons : outils de grande précision dont les instructions de stockage et de maniement doivent être documentés et appliqués.

Mesure de temps Chronomètres : étalonnage sur l’horloge parlante - Vérifier la remise à zéro du chronomètre  - Téléphoner à l’horloge parlante : n° 3699 (numéro court)  - Déclencher le chronomètre au 4ème top d’une heure quelconque mais notée  - Raccrocher le téléphone  - Attendre au moins une heure  - Rappeler l’horloge parlante, et arrêter le chronomètre au 4ème top de l’heure suivante  - Noter l’écart entre le temps officiel et le temps mesuré Cet écart est alors pris en compte pour corriger les mesures de temps au prorata du délai à mesurer : si l’écart est de 3 secondes sur une heure, la correction pour un délai de 15 minutes sera égale à – ¾ de seconde - Enregistrer ces opérations et les résultats

Instruments de mesure intégrés Confirmation métrologique par leur étalonnage avant, et régulièrement au cours de leur utilisation Etalonnage solutions étalons fournies par le fabricant, raccordées au SI respect des protocoles adaptés  Vérification assurée par les opérations de contrôle internes les évaluations externes

Documentation La documentation relative à la métrologie peut comprendre : • des documents de base • des procédures, protocoles et instructions, • des enregistrements Documents de base •Textes généraux : norme NF EN ISO 15189:2012, SH REF 02, en principe déjà présents dans le système documentaire du LBM •Textes plus spécifiques : normes relatives à la métrologie, en particulier la norme NF EN ISO 10012, A. Daunizeau - Paris, 15 mai 2014

Documentation Documents relatifs à la fonction de métrologue Liste des équipements critiques Procédures d’étalonnage Protocoles, limites, conduites à tenir en cas d’alarme Protocoles de vérification Enregistrements Certificats Relevés divers Suivi des anomalies

Procédures, protocoles, instructions • Procédure de gestion des équipements • Procédure de gestion de la métrologie • Protocoles d’utilisation des différents appareils et logiciels • Procédure d’estimation des incertitudes d’étalonnage (raccordement en interne) • Protocoles d’étalonnage et de vérification (nature, fréquence, modalités) • Modes de reconstitution des étalons et des contrôles • Protocoles de maintenance et d’entretien • Protocoles d’interprétation des étalonnages et des contrôles (limites d’acceptabilité, A. Daunizeau - Paris, 15 mai 2014

Certificat d’étalonnage Informations de type administratif identification de l’organisme chargé de l’étalonnage identification du LBM demandeur de l’étalonnage titre du document et numéro d’identification nombre de pages du document date de l’étalonnage nom, titre et signature du responsable de la fonction métrologique    Informations sur le protocole d’étalonnage identification de l’instrument (nom, type, constructeur, numéro de série, numéro d’inventaire interne) étalon utilisé et son raccordement conditions d’étalonnage méthode d’étalonnage déroulement des opérations 

Certificat d’étalonnage   - résultats et incertitudes correspondantes date d’étalonnage conditions ambiantes (température, pression, hygrométrie) description de l’instrument étalonné résultats d’étalonnage, comprenant en particulier ; - les valeurs vraies (fournies par l’instrument-étalon) - les valeurs lues (par l’instrument à étalonner) - les corrections (= valeurs vraies – valeurs lues) - les incertitudes associées - annexes éventuelles Certificat d’étalonnage Résultats et incertitudes correspondantes date d’étalonnage conditions ambiantes (température, pression, hygrométrie) description de l’instrument étalonné résultats d’étalonnage, comprenant en particulier ; - les valeurs vraies (fournies par l’instrument-étalon) - les valeurs lues (par l’instrument à étalonner) - les corrections (= valeurs vraies – valeurs lues) - les incertitudes associées   Annexes éventuelles

Certificat de vérification   - résultats et incertitudes correspondantes date d’étalonnage conditions ambiantes (température, pression, hygrométrie) description de l’instrument étalonné résultats d’étalonnage, comprenant en particulier ; - les valeurs vraies (fournies par l’instrument-étalon) - les valeurs lues (par l’instrument à étalonner) - les corrections (= valeurs vraies – valeurs lues) - les incertitudes associées - annexes éventuelles Certificat de vérification Mêmes informations administratives Informations techniques : tout ou partie en fonction des instruments Résultats des opérations qui découlent de la confrontation à la prescription et qui permettent de prononcer la remise en service 

Exemple pour une pipette de 50 µL   - résultats et incertitudes correspondantes date d’étalonnage conditions ambiantes (température, pression, hygrométrie) description de l’instrument étalonné résultats d’étalonnage, comprenant en particulier ; - les valeurs vraies (fournies par l’instrument-étalon) - les valeurs lues (par l’instrument à étalonner) - les corrections (= valeurs vraies – valeurs lues) - les incertitudes associées - annexes éventuelles Exemple pour une pipette de 50 µL

Conclusion Définir une politique de métrologie - définir la fonction métrologie (fonction-clé, organigramme) - nommer un responsable qualifié - définir les actions : métrologie interne ou sous-traitée Recenser le parc des instruments concernés Vérifier la traçabilité métrologique - certificats d’étalonnage, constats de vérification Etablir la documentation spécifique - référentiels, fiches de vie, … - enregistrements A. Daunizeau - Paris, 15 mai 2014