TP de virologie Septembre-Octobre 2012 LS3-7 Thomas Hoffmann François Helle Etienne Brochot

Classification des pathogènes Classement des agents biologiques en 4 groupes en fonction de l’importance du risque d’infection qu’ils présentent 1 : non susceptibles de provoquer une maladie chez l’homme ex. : certains virus végétaux 2 : pouvant provoquer une maladie chez l’homme, propagation dans la collectivité peu probable, le plus souvent prophylaxie ou traitement efficaces ex. : HPV, CMV, grippe, HSV, ROR 3 : pouvant provoquer une maladie grave chez l’homme, risque important de propagation dans la collectivité, généralement prophylaxie ou traitement efficace ex. : VHC, VHB, VIH, grippe 4 : provoquent des maladies graves chez l’homme, risque très élevé de propagation dans la collectivité, le plus souvent ni prophylaxie ni traitement efficace ex. : Ebola, Lassa, variole

Confinements et équipements : L2 Zone dédiée Travail sous hotte Surblouse

Confinements et équipements : L3 Sas, cascade de dépressions Travail sous hotte, autoclave « de transfert » Combinaison, masque, surchausses

Confinements et équipements : L4 Plusieurs sas, cascade de dépressions Travail sous hotte, appareil de destruction d’échantillons Combinaison renforcée, scaphandre, dispositifs à oxygène

Diagnostic des infections virales Diagnostic direct Diagnostic indirect

Diagnostic des infections virales Diagnostic direct C’est la mise en évidence du virus par la détection d’un de ses constituants ou de la particule virale entière: Virus entier Antigène viral Génome viral

Diagnostic des infections virales Diagnostic direct Virus entier Antigène viral Génome viral

Diagnostic direct: 1-Virus entier Mise en évidence du virus entier : Visualisation : Quel grossissement est nécessaire à la mise en évidence d’un virus entier ? Quel type de microscopie faudra-t-il utiliser :             - Microscopie optique ?             - Microscopie électronique ?

Diagnostic direct: 1-Virus entier

Diagnostic direct: 1-Virus entier 1/ Microscopie électronique Très rarement… (pour les virus non cultivables)

Diagnostic direct: 1-Virus entier 1/ Microscopie électronique Très rarement… (pour les virus non cultivables) Particules virales ne sont détectables qu’en concentration suffisante dans les prélèvements examinés (106 par mL), seuil rarement atteint, en dehors des diarrhées virales ou des liquides de vésicules  Multiplication du virus

Diagnostic direct: 1-Virus entier Mise en évidence du virus entier : Visualisation : Quel grossissement est nécessaire à la mise en évidence d’un virus entier ? Quel type de microscopie faudra-t-il utiliser :             - Microscopie optique ?             - Microscopie électronique ? Isolement : Culture cellulaire

Diagnostic direct: 1-Virus entier Culture cellulaire: Equipement +++ hotte à flux laminaire car manipulations en environnement stérile Microscope Incubateur à CO2 …

Diagnostic direct: 1-Virus entier 2/ Cultures cellulaires virales: Tous les virus ne se multiplient pas en culture de cellules in vitro, et chaque virus a un tropisme cellulaire propre. Utilisation de différents types cellulaires en fonction du tropisme du virus La multiplication virale peut se traduire par un effet cytopathique ou ECP évocateur d'un virus ou d'une famille de virus. Généralement utilisée pour les virus induisants un effet cytopathogène (=ECP ; ex : syncytia, mort cellulaire…)

Diagnostic direct: 1-Virus entier 2/ Cultures cellulaires virales: Technique de référence Virus = parasites intracellulaires obligatoires Ne peuvent se multiplier que dans des cellules vivantes animal (Coxsackievirus A types1 à 6) œuf de poule embryonné (virus de la grippe, poxvirus) cellules en culture in vitro Importance d’un transport rapide jusqu’au laboratoire pour conserver le pouvoir infectieux du virus

Diagnostic direct: 1-Virus entier

Diagnostic direct: 1-Virus entier Apparition d’un effet cytopathique de 48h à 21 jours morphologie ≠ en fonction du virus

Diagnostic direct: 1-Virus entier

Diagnostic direct: 1-Virus entier 2/Culture cellulaire Avantages : Très bonne sensibilité (méthode de référence) Indispensable pour disposer de souches utilisées pour la mise au point de vaccins (vaccin grippal) Coût raisonnable Limites : Délai d’obtention du résultat : 48h à 10 jours Subjectivité de la lecture Certains virus sont non cultivables : AdV 41, HBV

Diagnostic direct: 1-Virus entier La culture cellulaire virale peut permettre de quantifier le nombre de particules virales infectieuses : Methodes des plages de lyse (Rq: Particules physiques = infectieuses + non infectieuses)  Quantification en Foyers Formants Unités/mL (FFU/mL) Exercice 1: On a déposé dans chaque puits 200 µL de suspension virale aux dilutions indiqués. Quel est d’après vous le titre viral pour cet échantillon(en FFU/mL)?

Diagnostic direct: 1-Virus entier 2/Culture cellulaire L'identification précise du virus en cause fait ensuite appel à des techniques immunologiques (immunofluorescence, immunoenzymatiques...) qui vont mettre en évidence un constituant de la particule virale utilisation d’anticorps spécifiques (ex: HSV 16h, CMV 72h, virus respiratoires…)

Diagnostic des infections virales Diagnostic direct Virus entier Antigène viral Génome viral

Diagnostic direct: 2-Mise en évidence des antigènes viraux protéines d’enveloppes → ex : antigénémie HBs HBV capside → ex : antigénémie HCV autres protéines codées par le génome viral → ex : antigénémie pp65 CMV

Diagnostic direct: 2-Mise en évidence des antigènes viraux

Diagnostic direct: 2-Mise en évidence des antigènes viraux utilisation d’anticorps spécifiques (ex: HSV 16h, CMV 72h, virus respiratoires…)

Diagnostic direct: 2-Mise en évidence des antigènes viraux Immunofluorescence Applications diagnostiques : Infections cutanéo-muqueuses à HSV ou VZV Infections respiratoires

Diagnostic direct: 2-Mise en évidence des antigènes viraux Adenovirus Parainfluenza 3

Diagnostic direct: 2-Mise en évidence des antigènes viraux Agglutination ELISA Diagnostic direct: 2-Mise en évidence des antigènes viraux Ex : Ag p24

Diagnostic direct: 2-Mise en évidence des antigènes viraux L’immunochromatographie = TDR Techniques simples et rapides à mettre en œuvre mais manque de sensibilité

Diagnostic direct: 2-Mise en évidence des antigènes viraux Applications : selles (rotavirus, adénovirus) pvts respiratoires (VRS, grippe)

Diagnostic direct: 2-Mise en évidence des antigènes viraux Test de diagnostic rapide (TDR):  tests permettant une prise en charge plus rapide (traitement ou isolement du patient, ex: virus des gastroentérites, VRS, grippe, VIH)

Détection des antigènes viraux Diagnostic direct: 2-Mise en évidence des antigènes viraux En conclusion Détection des antigènes viraux Simple Rapide Ac et Ag Peu sensible Spécificité à contrôler Immunochromatographie Agglutination ELISA Immunofluorescence…

Diagnostic des infections virales Diagnostic direct Virus entier Antigène viral Génome viral

Diagnostic direct: 3- Mise en évidence des génomes viraux Mise en évidence du génome viral : PCR (réaction de polymérisation en chaîne)  simple détection (qualitatif) Très sensible et applicable à tous les virus connus Cf principe : http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm PCR en temps réel pour la quantification des génomes viraux (quantitatif) notion de "charge virale".

PCR : Circuit des prélèvements 1- Réception et aliquotage des prélèvements Cheminement des analyses dans le bao : 1- réception et aliquotage (4 aliquots 1 pour la culture, 1 pour la PCR et 2 en réserve conservés à -80°C non touchés si besoin) mise en culture même pièce mais PSM voisin 2 – extraction 113 3- mélange 101 4 – pièce blanche 5- amplification Marche en avant limite les risque de conta 37 37

PCR : Circuit des prélèvements 2- Extraction automatisée des acides nucléiques Cheminement des analyses dans le bao : 1- réception et aliquotage (4 aliquots 1 pour la culture, 1 pour la PCR et 2 en réserve conservés à -80°C non touchés si besoin) mise en culture même pièce mais PSM voisin 2 – extraction 113 3- mélange 101 4 – pièce blanche 5- amplification Marche en avant limite les risque de conta 38 38

PCR : Circuit des prélèvements 3- Préparation du mélange réactionnel pour PCR Cheminement des analyses dans le bao : 1- réception et aliquotage (4 aliquots 1 pour la culture, 1 pour la PCR et 2 en réserve conservés à -80°C non touchés si besoin) mise en culture même pièce mais PSM voisin 2 – extraction 113 3- mélange 101 4 – pièce blanche 5- amplification Marche en avant limite les risque de conta 39 39

PCR : Circuit des prélèvements 4- Mélange Cheminement des analyses dans le bao : 1- réception et aliquotage (4 aliquots 1 pour la culture, 1 pour la PCR et 2 en réserve conservés à -80°C non touchés si besoin) mise en culture même pièce mais PSM voisin 2 – extraction 113 3- mélange 101 4 – pièce blanche 5- amplification Marche en avant limite les risque de conta 40 40

PCR : Circuit des prélèvements 5- Amplification et révélation Cheminement des analyses dans le bao : 1- réception et aliquotage (4 aliquots 1 pour la culture, 1 pour la PCR et 2 en réserve conservés à -80°C non touchés si besoin) mise en culture même pièce mais PSM voisin 2 – extraction 113 3- mélange 101 4 – pièce blanche 5- amplification Marche en avant limite les risque de conta 41 41

Diagnostic direct: 3- Mise en évidence des génomes viraux Patients : 1 2 3 4 Résultats : ++ + + -

Diagnostic indirect

Mise en évidence de la réponse immunitaire spécifique Diagnostic indirect: Mise en évidence de la réponse immunitaire spécifique Connaître le statut d’un individu vis-à-vis d’un virus : - Infection guérie (Rubéole, Rougeole, Varicelle), Infection chronique (hépatite C, VIH) - Donneur de sang , d’organes, de tissus, de cellules, de gamètes, de lait - D’un patient-source suite à un accident d’exposition au sang (AES) ou une exposition sexuelle Diagnostiquer une infection en cours Evaluer l’efficacité d’une vaccination (Titrage des Ac protecteurs (VHA, VHB, grippe, ...))

Méthodes Western blot Western Blot VIH Diagnostic indirect Mise en évidence de la réponse immunitaire spécifique Méthodes Western blot Western Blot VIH

Diagnostic indirect Mise en évidence de la réponse immunitaire spécifique Méthodes ELISA

Diagnostic indirect Mise en évidence de la réponse immunitaire spécifique

Diagnostic indirect Avantages et inconvénients Bonnes sensibilité et spécificité Automatisation Délai de rendu du résultat Limites : Moindre sensibilité chez certaines catégories de patients (nourrissons et sujets immunodéprimés) Interprétation parfois délicates : réactivité croisée au sein d’une même famille, présence possible d’IgM lors de réactivation

Autres techniques en virologie: Détermination de la sensibilité d’un virus à une molécule antivirale CE50: concentration efficace de l’antiviral qui permet d’inhiber 50% de l’infection virale CT50: concentration toxique de l’antiviral qui entraine la mort de 50% des cellules en culture Index de sélectivité ou index thérapeutique: CT50/CE50 plus ce rapport sera élevé, plus la molécule en question sera capable d’inhiber la réplication du virus sans engendrer de toxicité

Autres techniques en virologie: Détermination de la sensibilité d’un virus à une molécule antivirale Evaluation de l’activité de nouveaux antiviraux sur un virus Détermination la sensibilité d’un virus isolé chez un patient à un antiviral

Autres techniques en virologie: Etude de la séquence génomique Permet de connaitre la composition précise de chaque souche virale - Etudier des mutations de résistance à une molécule antivirale (ex VIH). Classer les virus au sein d’une même famille virale (ex: génotypage du VHC)  Exercice 2

Principe de la réaction ELISA ELISA : Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay 1/ Formation d’un complexe Ag-Ac 2/ Détection du complexe Ag-Ac par fixation d’un Ac anti-immunoglobuline humaine marqué Anti-Ac Par une enzyme (méthode immuno-enzymatique) Anticorps Par une molécule fluorescente (immuno-fluorescence) Antigène

Supports de sérologie virale Techniques Manuelles Puits colorés = sérums positifs pour la réaction ELISA. Lecture des DO par spectrophotométrie Techniques Automatisées

Avantages et limites Avantages : Limites : Bonnes sensibilité et spécificité Automatisation Délai de rendu du résultat Limites : Moindre sensibilité chez certaines catégories de patients (nourrissons et sujets immunodéprimés) Interprétation parfois délicates : réactivité croisée au sein d’une même famille, présence possible d’IgM lors de réactivation (HHV)

Diagnostic direct « rapide » : avantages et limites Rapidité de rendu de résultat Limites : Manque de sensibilité Immunofluorescence : lecture au microscope fonction de l’expérience de l’observateur

Diagnostic direct par culture : avantages et limites Très bonne sensibilité (méthode de référence) Indispensable pour disposer de souches utilisées pour la mise au point de vaccins (vaccin grippal) Coût raisonnable Limites : Délai d’obtention du résultat : 48h à 10 jours Subjectivité de la lecture Certains virus sont non cultivables : HCV, HBV

Séquençage nucléotidique Méthode de Sanger

Diagnostic moléculaire : indications Techniques qualitatives : montrer la présence d’un virus Techniques quantitatives : suivi des patients traités par des antiviraux (HIV, HBV, HCV, CMV…) Séquençage : Caractérisation des génotypes viraux (HCV) Détection de mutations nucléotidiques associées à la résistance aux antiviraux (HIV, HBV) Caractérisation du tropisme viral (HIV) Analyse phylogénétique pour retracer l’origine d’une infection

Diagnostic moléculaire : avantages et limites Grande sensibilité des tests disponibles Automatisation +++ Délai raccourci de rendu de résultat (urgences) Limites : Absence de preuve du caractère infectieux du virus Equipements et personnels expérimentés Coût relativement élevé