Journées Jeunes Chercheurs Condorcet 2016 Projet STiLROOT Développement de racines transformées de vigne pour l'étude du métabolisme et de la bioproduction des stilbènes Journées Jeunes Chercheurs Condorcet 2016 Projet STiLROOT Leo-Paul Tisserant Encadrement : Pr. Christophe Clément Pr. Michèle Boitel Dr. Eric Courot

Introduction Hairy Roots Cinétiques Profil phytochimique Conclusion Les Stilbènes Les stilbènes sont des molécules de défense importantes pour la vigne Le resvératrol est le plus connu et étudié La biosynthèse des dérivés de resvératrol est peu connue et leur production est difficile Intérêt cosmétique et pharmaceutique t-Resvératrol

Production actuelle Biotechnologies Renouée du Japon Sarments de vigne Introduction Hairy Roots Cinétiques Profil phytochimique Conclusion Production actuelle Biotechnologies Levures Bactéries Cellules végétales Renouée du Japon Source principale Resvératrol glycosylé uniquement Produit de la taille des sarments et charpentes de vigne, photo Frédéric Douard Sarments de vigne Source de dérivés de resvératrol Récupération difficile

La voie métabolique Questions restantes Autres réactions? Régulation? Introduction Hairy Roots Cinétiques Profil phytochimique Conclusion La voie métabolique Cinnamate PAL Phenylalanine Questions restantes C4H Autres réactions? Régulation? Chronologie? Transport? Métabolisme racinaire? Localisation racinaire ? p-Coumarate TAL Tyrosine 4CL p-Coumaroyl-CoA + 3x Malonyl-CoA STS Resveratrol - Viniferins - cis/trans Glycosides Oligomers Isoprenylation Oxydation Isomers Methoxylation - Cross reactions Other reactions? t Ɛ-viniferin, Piceid Arachidin-3 Oxyresveratrol c-resveratrol Pterostilbene Multiple steps Single step Exact mecanism unknown Activation Inhibition t-Ɛ-methylviniferin t-δ-viniferin t-α-viniferin Piceatannol Mulberroside A c-piceid

Le projet STiLROOT Les étapes du projet Introduction Hairy Roots Cinétiques Profil phytochimique Conclusion Le projet STiLROOT Les étapes du projet Etablissement des lignées de racines transformées Stabilisation et criblage Amélioration des conditions de culture Cinétiques de croissance et de production Elicitation Etude du métabolisme Etude de localisation

Les racines transformées Introduction Hairy Roots Cinétiques Profil phytochimique Conclusion Les racines transformées Transformation par Rhizobium rhizogenes Phénomène naturel Transfert d’ADN T Induction de l’apparition de racines Caractéristiques des HR Croissance indéfinie Caractéristiques comparables aux racines naturelles Stabilité génétique Pas besoin d’hormones Brassica rapa Catharanthus spp Kirsi Marja Oksmann, VTT. Panax spp. Muscadine Nopo-Olazabal et al. 2013

Initiation des lignées Introduction Hairy Roots Cinétiques Profil phytochimique Conclusion Initiation des lignées Vitroplants : Vitis vinifera Pinot Noir 40024 Bactéries: Rhizobium rhizogenes ATCC 15834

Génération des HR de vigne Introduction Hairy Roots Cinétiques Profil phytochimique Conclusion Génération des HR de vigne Isolement et culture Plus de 400 lignées 80 seulement on survécu Cultivées et multipliées gélosé puis liquide Choix d’une lignée avec une bonne croissance

Cinétique de croissance Introduction Hairy Roots Cinétiques Profil phytochimique Conclusion Cinétique de croissance Cinétiques Croissance Production Milieu ½ SH, 2% saccharose 3 mesures / point - 1 2 3 - Pas de phase de latence Phase exponentielle : Td = 6,2 jours et µ = 0,11 j-1 Phase de ralentissement Phase stationnaire 1 2 3

Etude du métabolisme Identification des molécules Introduction Hairy Roots Cinétiques Profil phytochimique Conclusion Etude du métabolisme HPLC – MSMS sur extrait de racines 906 Vitisine B ou C Identification des molécules Vue globale sur le métabolisme Suivi de leur évolution au cours de la culture Flux métabolique Réponse à différentes traitements d’induction 680 406 Astringine 940 ε-Viniferine-tri-Glc 390 Z-Piceide 778 ε-Viniferine-di-Glc 536 470 Ampelopsine A 542 ? 470 390 E-piceide 906 Hopeaphenol 616 Viniferine-Glc 454 ε-Viniferine 906 680 906 906 + 680 t-α-viniferin Hopeaphenol Resveratrol-based Resveratrol t-δ-viniferin t Ɛ-viniferin EN COURS Resveratrol dimer-based Resveratrol trimer-based Resveratrol tetramer-based

Conclusion et perspectives Introduction Hairy Roots Cinétiques Profil phytochimique Conclusion Conclusion et perspectives Mise en place des cultures de racines transformées Croissance infinie établie Cinétique de croissance définie Evolution quantitative du profil Niveaux de production intéressants (Brevet en cours) Etude du métabolisme Identification des stilbènes produits Réponse à l’induction de la synthèse des stilbènes Valide l’outil d’étude de ce métabolisme et pose les premiers éléments de cette étude

Je vous remercie pour votre attention ! Christophe Clément Eric Courot Aziz Aziz Jérôme Crouzet Gabriel Guihard Claire Hebrard Hélène Baraille Clarisse Rabenoelina Isabelle Roberrini Michèle Boitel Michelle Lequart Solène Bassard Olivier Habrylo Nathalie Jullian François Guérineau Jane Hubert David Lesur Eric Grand Serge Pilard Antoine Champagne Christine Terryn Financements