Recherche et optimisation des amorces pour la PCR Etape cruciale de la réussite de la PCR Les amorces doivent être spécifiques, stables et compatibles

Amorce gauche et amorce droite Peut être déterminé à l’aide de SMS2 Sequence Manipulation Suite 2

Zone d’hybridation unique L’amorce doit s’hybrider avec une seule zone de l’ADN matrice Il est nécessaire d’établir la carte d’hybridation des amorces avec l’ADN matrice EXEMPLE Amorce spécifique 5’-CGACGGACGACG-3’ |||||||||||| 5’-TGATACATCGCCGTCGTCGT……………………CGACATCGCCGTCGTACCCGTCGTCCGTCGGG-3’ |||||||||||| 5’-CGACGGCGATGT-3’ |||||||||||| 5’-CGACGGCGATGT-3’ Amorce non spécifique Résultat obtenu avec Sequence Manipulation Suite 2

Spécificité de l’amorce L’amorce doit être spécifique du gène ou de l’espèce recherchée. Elle ne doit pas s’hybrider avec un ADN contaminant Pour le vérifier on peut réaliser un alignement local avec BLAST EXEMPLE 5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’ Amorce gauche utilisée pour détecter Salmonella sp *Letters in Applied Microbiology 2003, 36, 217–221

Longueur des amorces La longueur de l’amorce influe sur la température de fusion (Tm), la température d’hybridation (Ta) et la spécificité Spécificité et Tm augmentent avec la longueur En général 18-30 nucléotides

Composition des amorces La composition en bases de l’amorce influe sur la température de fusion (Tm), la température d’hybridation (Ta) et la spécificité La Tm augmente avec le %GC En général compris entre 40-60% Il faut éviter les zones riches en AT ou en CG, la répartition des bases doit être de préférence aléatoire

Détermination du Tm et Ta Règle de Wallace Tm = 4 . (nG + mC) + 2 . (pA + qT) Règle tenant compte de la longueur et les sels monovalents (M) Tm = 81,5 + 16,6 . Log([M+]) + 0,41 . (%GC) – 675 / L Melting temperature Méthode thermodynamique (nearest-neighbour base model) Méthode la plus précise car elle tient compte de la séquence (forces d’empilement des bases) et pas uniquement du %GC Liens pour détermination Tm par différentes méthodes Annealing temperature Ta = 0,3 . Tm(amorce) + 0,7 . Tm(amplicon) - 14,9

Stabilité de l’extrémité 3’ La stabilité de l’extrémité 3’ conditionne une bonne initiation de la polymérisation. 3’ 5’ 3’ 5’ Extrémité 3’ stable Extrémité 3’ instable On privilégie la présence de quelques bases GC en 3’, mais pas en grand nombre car on risque de provoquer des fixations non spécifiques 5’-TGATACATCGCCGTCGTCGT……………………CGACATCGCTCGTCCGTCGGTCGTCCGTCGGG-3’ GCG-3’ ||| 5’-CGACGGACGA ||||||||||||| 5’-CGACGGACGAGCG-3’ False priming

Dimères et épingles à cheveux Les amorces ne doivent pas s’autohybrider (self-dimer) ni s’hybrider entre elles (dimer), ni former des structures en épingles à cheveux (hairpin) La stabilité de ces structures est évaluée par le DG. Liens pour analyser les primers (Netprimer)

Compatibilité des amorces Les amorces doivent avoir des Ta proches et par conséquent des Tm proches La différence des Ta ne doit pas excéder 2 à 3 °C

Exercice Recherche du gène invA de Salmonella typhimurium dans GENBANK Recherche d’amorces simples et vérification de leur qualité Recherche d’amorces optimisées avec Primer3 Recherche d’amorces optimisées avec PerlPrimer

Recherche du gène invA de Salmonella typhimurium

Résultats

Séquence du gène invA de Salmonella typhimurium >gi|154154|gb|M90846.1|STYINVA Salmonella typhimurium InvA (invA) GATATTGCCTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCGTACTATTGAAAAGCTGTCTTAATTTAATATTA ACAGGATACCTATAGTGCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGT ACTAATGGTGATGATCATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCA CTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAA CGTTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCATTATCGATCAGTACCAGTCGTCTTAT CTTGATTGAAGCCGATGCCGGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCGTTATTGGCGATAGCCTGGCG GTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGTG TCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTT GAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCCGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTT TACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATCTTTG TGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACTCGCCATGGTATGGATTTGTCCTCCGCCCTGTCTAC TTATACCATGCTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCCCGCATTGTTGATTGCGATTAGTGCC GGTTTTATCGTGACCCGCGTAAATGGCGATACGGATAATATGGGGCGGAATATCATGACGCAGCTGTTGA ACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTGACCATTTCAATGGGAACTCTGCCGGGATTCCCACT GCCGGTTTTTGTTATTTTATCGGTGGTTTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGT AGCGCCGCCAAACCTAAAACCAGCAAAGGCGAGCAGCCGCTCAGTATTGAGGAAAAAGAAGGGTCGTCGT TAGGACTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAG CCGGCGTGAAGATCTGGAAAAAGCTCAACTTGCGGAGCGTCTACGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGC GTGCGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGAGATGGCGAGGGCCTGGACGATAACAGCATCGTATTGTTGATTA ATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCTATTTTGATTTGATGCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT CGTGTCCTTTGGTATTAATCCAACAATCCATCAGCAAGGTAGCAGTCAGTATTTCTGGGTAACGCATGAA GAGGGGGAGAAACTCCGGGAGCTTGGCTATGTGTTGCGGAACGCGCTTGATGAGCTTTACCACTGTCTGG CGGTGACCGTGGCGCGCAACGTCAATGAATATTTCGGTATTCAGGAAACAAAACATATGCTGGACCAACT GGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCTCAGACATGCCACGGTACAACGTATATCTGAAGTT TTGCAGCGTTTGTTAAGCGAACGTGTTTCCGTGCGTAATATGAAGTTAATTATGGAAGCGCTCGCATTGT GGGCGCCAAGAGAAAAAGATGTCATTAACCTTGTGGAGCATATTCGTGGAGCAATGGCGCGTTATATTTG TCATAAATTCGCCAATGGCGGCGAATTACGAGCAGTAATGGTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGC AAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTCAGCCTTGACCCGGAAGCCTCCGCTAATTTGATGG ATCTCATTACACTTAAGTTGGATGATTTATTGATTGCACATAAAGATCTTGTCCTCCTTACGTCTGTCGA TGTCCGTCGATTTATTAAGAAAATGATTGAAGGTCGTTTTCCGGATCTGGAGGTTTTATCTTTCGGTGAG ATAGCAGATAGCAAGTCAGTGAATGTTATAAAAACAATATAAGGGCTTAATTAAGGAAAAGATCTATGCA ACATTT Séquence cible à amplifier (300 nt) Séquence du gène au format FASTA

Amorces non optimisées Amorces déduites des séquences en amont et en aval >gi|154154|gb|M90846.1|STYINVA Salmonella typhimurium InvA (invA) GATATTGCCTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCGTACTATTGAAAAGCTGTCTTAATTTAATATTA ACAGGATACCTATAGTGCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGT ACTAATGGTGATGATCATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCA CTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAA CGTTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCATTATCGATCAGTACCAGTCGTCTTAT CTTGATTGAAGCCGATGCCGGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCGTTATTGGCGATAGCCTGGCG GTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGTG TCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTT GAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCCGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTT TACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATCTTTGTGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACTCGCCATGGTATGGATTTGTCCTCCGCCCTGTCTAC TTATACCATGCTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCCCGCATTGTTGATTGCGATTAGTGCC GGTTTTATCGTGACCCGCGTAAATGGCGATACGGATAATATGGGGCGGAATATCATGACGCAGCTGTTGA ACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTGACCATTTCAATGGGAACTCTGCCGGGATTCCCACT GCCGGTTTTTGTTATTTTATCGGTGGTTTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGT AGCGCCGCCAAACCTAAAACCAGCAAAGGCGAGCAGCCGCTCAGTATTGAGGAAAAAGAAGGGTCGTCGT TAGGACTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAG CCGGCGTGAAGATCTGGAAAAAGCTCAACTTGCGGAGCGTCTACGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGC GTGCGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGAGATGGCGAGGGCCTGGACGATAACAGCATCGTATTGTTGATTA ATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCTATTTTGATTTGATGCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT CGTGTCCTTTGGTATTAATCCAACAATCCATCAGCAAGGTAGCAGTCAGTATTTCTGGGTAACGCATGAA GAGGGGGAGAAACTCCGGGAGCTTGGCTATGTGTTGCGGAACGCGCTTGATGAGCTTTACCACTGTCTGG CGGTGACCGTGGCGCGCAACGTCAATGAATATTTCGGTATTCAGGAAACAAAACATATGCTGGACCAACT GGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCTCAGACATGCCACGGTACAACGTATATCTGAAGTT TTGCAGCGTTTGTTAAGCGAACGTGTTTCCGTGCGTAATATGAAGTTAATTATGGAAGCGCTCGCATTGT GGGCGCCAAGAGAAAAAGATGTCATTAACCTTGTGGAGCATATTCGTGGAGCAATGGCGCGTTATATTTG TCATAAATTCGCCAATGGCGGCGAATTACGAGCAGTAATGGTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGC AAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTCAGCCTTGACCCGGAAGCCTCCGCTAATTTGATGG ATCTCATTACACTTAAGTTGGATGATTTATTGATTGCACATAAAGATCTTGTCCTCCTTACGTCTGTCGA TGTCCGTCGATTTATTAAGAAAATGATTGAAGGTCGTTTTCCGGATCTGGAGGTTTTATCTTTCGGTGAG ATAGCAGATAGCAAGTCAGTGAATGTTATAAAAACAATATAAGGGCTTAATTAAGGAAAAGATCTATGCA ACATTT Amorce gauche 5’-TTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’ Amorce droite 5’-CCGCCAATAAAGTTCACAAA-3’

Analyse de l’amorce gauche avec Netprimer Mauvaise amorce : formation d’épingle, de dimères

Analyse de l’amorce droite avec Netprimer Mais Tm très différent de l’amorce gauche Pas d’épingle, pas de dimères

Recherche d’amorces avec Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm

Plusieurs couples d’amorces sont proposés Résultats avec Primer3 Plusieurs couples d’amorces sont proposés On remarque que le logiciel a trouvé d’autres amorces plus optimisées mais pas à la même position Légende ****** cible >>>>>> amorce gauche <<<<<< amorce droite

Recherche d’amorces avec PerlPrimer Il s’agit d’un logiciel libre téléchargeable Définir la région à amplifier Copier/coller la séquence Visualisation et analyse des amorces Visualisation de la séquence et des amorces Recherche des amorces

Résultats avec PerlPrimer Analyse de la qualité des amorces On peut réaliser un Blast directement pour vérifier la spécificité des amorces

Résultats de l’analyse avec Blast Les primers choisies s’alignenent en uniquement avec des séquences provenant de Salmonella