UTILISATION DE LA PCR DIGITALE POUR LA RECHERCHE D’ANEUPLOÏDIES FŒTALES D Le Tessier, A Coustier, L El Khattabi Laboratoire de Cytogénétique. Hôpital Cochin

Le diagnostic prénatal en france 54920 prélèvements invasifs en 2012 Données 2012, Agence Biomédecine

Anomalies diagnostiquées 11,2% de caryotypes avec anomalie Données 2012, Agence Biomédecine

procédure invasive Obtention de cellules foetales objectif Villosités choriales Liquide amniotique Sang foetal objectif Obtention de cellules foetales Analyse de génétique moléculaire Mise en culture et établissement du caryotype foetal

MATERIEL FŒTAL DANS LE SANG MATERNEL ADN fœtal libre circulant Cellules fœtales circulantes ARN fœtal circulant

MATERIEL FŒTAL DANS LE SANG MATERNEL ADN fœtal libre circulant Cellules fœtales circulantes ARN fœtal circulant 6

ADN FŒTAL LIBRE CIRCULANT Origine trophoblastique Relargage dans circulation maternelle dès 5-6 SA Augmentation de la concentration au long de la grossesse Mélangé à l’ADN maternel (ADNf = 5-10%) Concentration ADNf à relier avec autres facteurs ½ vie courte: 16min. Disparition rapide (- 48h) après accouchement ADN fragmenté : 140bp 7

PROBLEMATIQUES Techniques : Biologiques/interprétation Faibles quantités Contamination maternelle nécessité de techniques très sensibles et précises: MPS PCR digitale  Importance du pré-analytique (tubes de prélèvement, traitement de l’échantillon, technique d’extraction) Biologiques/interprétation Faux positifs (MCP, clone maternel aneuploïde) Faux négatifs (aneuploïdies en mosaïque, proportion d’ADNf trop faible, grossesse gémellaire)

PCR digitale PCR classique PCR digitale point final point final quantitative PCR classique point final qualitative PCR en temps réel quantitative

PCR digitale Partitionnement PCR Lecture 1 1 1 1 1 Quantification

PCR DIGITALE en micropuce

PCR DIGITALE en émulsion

PCR DIGITALE en émulsion 13

PCR DIGITALE en émulsion PCR+ FAM PCR+ VIC PCR neg PCR+ FAM et VIC 14

PCR DIGITALE en émulsion N PCR+ FAM N PCR+ VIC N total (+ et -) 15

PCR DIGITALE en émulsion 16

PCR digitale Avantages par rapport à la PCR en temps réel : Technique plus sensible ( probabilité de rencontre entre l’ADN et les amorces-sonde,  phénomènes d’inhibition de PCR) Technique plus spécifique ( interactions entre différentes PCR) Pas besoin d’une courbe standard (c’est une vraie quantification absolue) 17

PCR digitale Applications : Virologie : charges virales résiduelles… Génétique somatique : détection d’allèles mineurs (évènements rares)… Génétique constitutionnelle : détection de CNV, DPNI +++ (détection de sexe fœtal, RhD, aneuploïdies) « Digital PCR for the molecular detection of fœtal chromosomal aneuploidy » Y.M. Dennis Lo et al. PNAS, August 7,2007,vol 104 (32),13116-13121l 18

PCR DIGITALE pour la trisomie 21 Mesure d’un ratio chromosomique 21/ref (≡ FAM/VIC) Fœtus euploïde  ratio = 1 Fœtus avec T21  ratio > 1 (valeur exacte dépend de la proportion d’ADNf. Par exemple, pr 10% d’ADNf, ratio = 1,05) FAM VIC 19

PCR DIGITALE pour la trisomie 21 Problématique : pour dire que 1,05 vraiment ≠ 1, il faut compter des milliers de molécules du 21. Or, la quantité d’ADN est limitée  idée du multiplexage avec des sondes de la même couleur FAM VIC 4 sondes FAM 4 sondes VIC 20

PCR DIGITALE : ETUDE DANNI DANNI: Dépistage Anténatal Non Invasif des maladies génétiques (Coordonnateur: JM Dupont, Cochin) Etude multicentrique, accord CPP Objectif principal: Évaluer les performances/coût des nouvelles technologies de comptage moléculaire dans le dépistage de trisomie 21 PCR digitale MPS Critères d’inclusion: Grossesses à haut risque d’anomalie chromosomique (marqueurs sériques à risque élevé, anomalies à l’échographie, histoire familiale) Caryotype fœtal par prélèvement invasif

PCR DIGITALE : ETUDE DANNI N = 220 échantillons d’ADN plasmatique (200 N, 20 T21) Description de la population étudiée : 35% MS1T+ 44% signes échographiques 14% MS1T+ et signes échographiques 3.6% histoire familiale 3.6% autres

PCR DIGITALE : ETUDE DANNI Médiane 1,00 1,08

CONCLUSION Approche prometteuse, possibilité d’améliorations techniques (choix des sondes,  multiplexage) Place de la dPCR dans le DPNI ? Avantages dPCR : Simple, rapide, faible coût, moins de logistique => Compatible avec un dépistage en population générale Dépend des évolutions de coût et de technologie du MPS En cours : partenariat entre clinique canadienne et Biorad pour utilisation ddPCR pour le dépistage de la T21, proposition RainDance)

REMERCIEMENTS Cytogénétique – Hôpital Cochin Audrey Coustier Laïla El Khattabi Jean-Michel Dupont Génétique – Hôpital Poissy Christelle Le Sciellour Valérie Serazin François Vialard DHU Risques et Grossesse Pr Vassilis Tsatsaris Françoise Le Rhun Camille Deput Rampon Pr Laurent Mandelbrot Pr Dominique Luton Gynécologie – Hôpital Poissy Patrick Rozenberg Alexandra Brette Berangère Duclos Plateforme ddPCR et MPS – Hôpital Cochin Juliette Nectoux Franck Letourneur Michel Vidaud Statistiques Raphael Porcher

1.MISES AU POINT TECHNIQUES - MATERIEL & METHODES 1. Digestion enzymatique de RASSF1A 3 types de tissus ADN placentaire ADN lymphocytaire ADN plasmatique RASSF1A hyperméthylé RASSF1A hypométhylé ADN maternel: hypométhylé ADN fœtal: hyperméthylé 5 protocoles de digestion P1 P2 P3 P4 P5 BSTUI HhaI + HpaII 60°C 37°C 1h puis 90°C 20 min 16h 1h 10 min Digestion par une enzyme méthyl-sensible Résistant digéré ADN maternel ADN fœtal résistant