Techniques immunologiques utilisant des réactifs marqués

Présentation au sujet: "Techniques immunologiques utilisant des réactifs marqués"— Transcription de la présentation:

1 Techniques immunologiques utilisant des réactifs marqués
Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) GRELIER – DURAND - POCHET

2 Principe et définitions
 Techniques utilisant une mise en évidence des immuns complexes par un conjugué Conjugué = Ag - marqueur ou Ac - marqueur  Marqueur = molécule détectable Isotope radioactif : émission de rayonnements Enzyme : catalyse la formation d’un produit coloré Fluorochrome : émission de fluorescence

3 Conjugués Conjugué = Antigène ou Anticorps marqué
Liaison du marqueur à l’Ag ou Ac laissant libre épitope ou paratope tout en diminuant leur affinité par rapport aux composés non marqués

4 Techniques en phase hétérogène ou homogène
Formation des complexes immuns sur un support Nécessite des étapes de lavage Les plus utilisées Phase homogène : Complexes immuns formés en phase liquide Pas d’étape de lavage Activité du marqueur différente quand le conjugué est libre ou lié

5 Techniques directes et indirectes
Marquage réalisé en 1 seule étape (hors lavages et révélation) 1 seul réactif utilisé Techniques indirectes : Marquage nécessitant plusieurs étapes Plusieurs réactifs utilisés Plusieurs complexes immuns formés

6 Techniques compétitives et non compétitives
Compétition entre un élément recherché son homologue marqué Ajout simultané des réactifs Techniques non compétitives : Ajout successif des réactifs Lavages entre 2 réactifs ajoutés

7 Radioimmunologie (RIA)
Marqueur = Isotope radioactif  élément chimique possédant les mêmes propriétés chimiques, le même Z que l’élément mais des masses atomiques différentes par nombre différent de neutrons caractérisé par une période ou demi-vie, un noyau énergiquement instable libérant de l’énergie sous forme de rayonnement : désintégration radioactive mesurée  Risque physique : utilisation limitée

8 Immunoenzymologie Marqueur = Enzyme Définition : catalyseur biologique
se fixant spécifiquement sur un substrat catalysant la formation d’un produit Exemples : Phosphatase alcaline (PAL) PNPP incolore PNP jaune Peroxydase (HRP) catalysant l’oxydation de divers substrats par l’intermédiaire de H2O2

9 Ac anti-Salmonella-PAL
ELISA non compétitive indirecte en phase hétérogène Ex : recherche de Salmonella dans un aliment Plaque 96 puits Produit (PNP) Substrat (PNPP) Lavage P P P P Ac anti-Salmonella-PAL S S S S Echantillon SAB Ac anti-Salmonella

10 ELISA compétitive directe en phase hétérogène Ex : dosage d’une toxine bactérienne
Produit P Substrat S Lavage Toxine (échantillon) S P Toxine marquée = Conjugué S SAB : saturation Anticorps anti-toxine

11 Immunofluorescence Marqueur = Fluorochrome  molécule capable :
d’absorber une lumière de faible longueur d’onde de passer un état excité de revenir à son état fondamental en émettant un rayonnement lumineux de longueur d’onde plus élevée S1’ S1 Énergie absorbée h ex Énergie émise h em So temps

12 Fluoresceine IsoThioCyanate Tetraméthyl Rhodamine IsoThioCyanate
Marqueurs Principaux fluorochromes utilisés Absorption Émission FITC Fluoresceine IsoThioCyanate 495 nm 525 nm TRITC Tetraméthyl Rhodamine IsoThioCyanate 545 nm 575 nm

13 Microscope à épifluorescence
Émission d’un rayonnement intense (UV et visible) par une lampe à vapeur de mercure ou faisceau LASER Focalisation par une lentille Sélection du spectre par un filtre d’excitation (490 nm) Diffraction du faisceau par le miroir dichroïque via l’objectif vers l’objet Excitation du fluorochrome Émission d’un rayonnement de plus faible énergie passant par l’objectif le miroir dichroïque un filtre sélectionnant les longueurs d’onde (> 500 nm) l’oculaire

14 Fixation du prélèvement
Immunofluorescence indirecte en phase hétérogène Ex : recherche de Taylorella equigenitalis dans des prélèvements vaginaux de jument Ac anti -Taylorella Lame IFI Fixation du prélèvement

15 Immunofluorescence indirecte en phase hétérogène Ex : recherche de Taylorella equigenitalis dans des prélèvements vaginaux de jument Lavages

16 Conjugué : Ac anti Ig - FITC
Immunofluorescence indirecte en phase hétérogène Ex : recherche de Taylorella equigenitalis dans des prélèvements vaginaux de jument Conjugué : Ac anti Ig - FITC

17 Immunofluorescence indirecte en phase hétérogène Ex : recherche de Taylorella equigenitalis dans des prélèvements vaginaux de jument Lavages

18 Immunofluorescence indirecte en phase hétérogène Ex : recherche de Taylorella equigenitalis dans des prélèvements vaginaux de jument - Résultats +

19 Immunofluorescence : autres techniques
Immunofluorescence directe en phase hétérogène Immunofluorescence en phase homogène (cytomètre de flux) Immunofluorescence indirecte sandwich