FivFrance Formation.

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1 FivFrance Formation

2 AUTOANTICORPS ANTI-SPERMATOZOIDES ACAS

3 Fréquences : - Population générale : 1%
- Hommes reconnus infertiles : 7 (3 - 15%) - Hommes suspectés d’auto-immunisation : 30 ( %)

4 Les principales causes
1 - Atteinte de l'intégrité de la barrière hémato testiculaire (BHT - Cellule de SERTOLI) 2 - Origines mécaniques ou chirurgicales - Cryptorchidies - Torsions testiculaires - Varicocèle - Suite de biopsie testiculaire - Suite de vasectomie

5 Les principales causes (suite)
3 - Origines infectieuses Infections bactériennes Inflammations chroniques du tractus génital E.Coli, Chlamydiae, Mycoplasme, levures Salmonelles.... Peuvent présenter des antigènes de structures calquant des antigènes de surface du spermatozoïde -> Induction de la formation d'anticorps anti-Spz.

6 Effets biologiques LOCALISATION ET EFFETS DELETERES
IgG (anticorps neutralisants) Localisation : circulation sanguine, plasma séminal, glaire IgA (anticorps neutralisants et agglutinants) Localisation : Muqueuses, Plasma séminal, Prostate, glaire Effets biologiques Dans le plasma séminal, à l’éjaculation : agglutination des spermatozoïdes Dans la glaire (IgA) : Immobilisation : Shaking phénomenon Effet sur la fertilité naturelle : Hypofertilité, Stérilité

7 Répercussions fonctionnelles Auto-agglutination des spermatozoïdes : Diminution de la pénétration dans la glaire - Impact sur la capacitation et la réaction acrosomique - Diminution de la fixation à la zona pellucide - Impact sur la pénétration dans l'ovocyte

8 5-8% des infertilités masculines
ont des ACAS

9 Antécédents uro-génitaux et anticorps anti-spermatozoïdes
Fréquence (%) des hommes avec ASA Selon pathologie (Frydman) anticorps retrouvés dans % des vasectomies 45 % Hernies inguinales 47 % des traumatismes 38 % des Agénésies des canaux déférents 50 % des Epididymites 35 % des Urethrites / prostatites

10 LIEUX DE FIXATION SUR LES SPERMATOZOIDES

11 SUR LES SPERMATOZOÏDES
RECHERCHE DES ACAS SUR LES SPERMATOZOÏDES

12 MAR-TEST : Mixed agglutination reaction Se pratique sur le sperme frais, en présence de SPZ mobiles. Technique d’origine avec Hématies humaines O Rh+

13 MAR-Test « Original »

14 LES REACTIFS PRETS A L’EMPLOI Particules synthétiques : Test direct sur sperme frais SpermMAR® tests IgA et test IgG – Fertipro MarScreen® tests IgA et IgG - Bioscreen inc. ImmunoSpheres ® tests IgA et IgG - Bioscreen inc 1- Mélanger du sperme frais homogénéisé et les particules de latex sensibilisées avec des IgG ou des IgA. 2 - Ajouter l’antisérum IgG ou IgA, mélanger 3 - Observer, au microscope, la fixation des particules sur les spermatozoïdes, ainsi que l’importance des agglutinants formés avec les particules de latex entre elles. 4 - Faire un compte sur spermatozoïdes vivants Photo :Grace M. Centola

15 Résultats Et incidence sur la technique d’AMP
< 50 % Test négatif >50 % Test positif TMS + : IIU possible ? TMS - : ICSI : ICSI TMS = Test de Migration - Survie (Traitement aux corticoïdes : trop d’effets secondaires)

16 x ACAS : PREPARATION DU SPERME EN VUE D’IIU
- Recueillir le sperme dans un récipient contenant déjà un liquide isotonique de dilution. Pour diluer la concentration d’anticorps afin de diminuer leur fixation sur le spermatozoïdes lors de l’éjaculation. Centrifuger rapidement dans plusieurs tubes de 15 ml. afin de réduire les temps de contact entre SPZ et anticorps x

17

18 Étude de la morphologie des spermatozoïdes
LE SPERMOCYTOGRAMME

19 Date et heure du recueil : Délai d’abstinence (j) :
Conjoint : Nom, Prénom, D.N Conjointe : Adresse : Médecin prescripteur : Date et heure du recueil : Délai d’abstinence (j) : SPERMOCYTOGRAMME Index de teratozoospermie (TZI) : Divers Flagelles isolés : SPZ en lyse : Autres Cellules : (macrophages,cell. épithéliales…) CONCLUSION : Nbre SPZ observés : Spz typiques : % Spz atypiques : % Anomalies de : Tête : % P.Intermédiaire : % P.Principale : % R.Cytoplasmique : %

20 LE SPERMOCYTOGRAMME - Préparation des lames - Colorations
Classification de Menkveld, Kruger et Coll. - Index de teratozoospermie (TZI) Criteres stictes de Tygerberg - South Africa

21 PREPARATION ET COLORATION DES LAMES
A - PREPARATION 1 Prendre une lame propre et dégraissée L1 2 Bien homogénéiser le sperme à analyser 3 Déposer de 5 à 10 microlitres, selon concentration 3 Faire glisser la lame L2 d’un geste régulier sur la lame L1 4 Toucher la goutte par contact avec la lame L2 5 Faire glisser la lame L2 d’un geste régulier sur la lame L1 6 Laisser sècher Faire au moins 2 lames

22 PREPARATION ET COLORATION DES LAMES
A - LES CAS SPECIAUX : 1 - Les oligospermies sévères (inf à 2 millions par ml) : Concentrer le sperme par centrifugation pendant 10 mn à 600g Eliminer les 3/4 du surnageant Homogénéiser le culot et évaluer la Concentration Diluer éventuellement pour ramener à millions/ml. 2 - les spermes hypervisqueux ou riches en éléments figurés Diluer une quantité de sperme au 1/20e dans du serum physiologique et centrifuger à 800g/ 10 mn. Eliminer tout le surnageant en conservant le culot Diluer le culot dans l. De sérum physiologique. Faire une Lame et contrôler l’homogeneité. **Lavage-Centrifugation : Artefacts possibles après coloration -> Mentionner les manipulations effectuées sur le compe-rendu d'analyses.

23 PREPARATION ET COLORATION DES LAMES
B- LA COLORATION DES SPERMATOZOÏDES : Les Techniques classiques : Coloration de Papanicolaou (fixation + coloration : mn) Coloration de Shorr (fixation + coloration : 35 mn) Avantages et inconvenients - Donne des images excellentes avec peu de coloration résiduelle du fond - Colorations longues à mettre en œuvre, nombreux réactifs, Intéressantes si automatisées PAPANICOLAOU SCHORR

24 PREPARATION ET COLORATION DES LAMES
B- LA COLORATION DES SPERMATOZOÏDES : La coloration de SHORR Mettre les lames séchées dans l’alcool à 75%(v/v) pendant une heure Rincer fois 1 seconde dans un bac d’eau du robinet Tremper dans la solution d’hématoxylline pendant 1,30 mn. Rincer fois fois 1 seconde dans un bac d’eau du robinet Tremper 10 fois dans la solution ammoniaque/éthanol Tremper dans une solution alcoolique à 50% (v/v) pendant 5 mn. Tremper dans le colorant de Shorr pendant 3-5 mn. Tremper dans une solution alcoolique à 75% (v/v) pendant 5 mn. Tremper dans une solution alcoolique à 95% (v/v) pendant 5 mn. Laisser secher verticalement sur un papier buvard Fixation : mn Coloration : mn

25 PREPARATION ET COLORATION DES LAMES
B- LA COLORATION DES ECHANTILLONS : Quelques Kits commercials utilisables : - Spermac stain (Fertipro) Sperm Morphostain (Nidacon) coloration Romanovsky en 1 étapes Diff Quick coloration Romanovsky en 3 étapes - Hemacolor* Merck Avantages et inconvenients Manipulation rapide bien adaptée à la routine Kits prêts à l’emploi, pratique à utiliser Bruit de fond important rendant la lecture plus délicate Modification des contours pouvant géner le passage sur un automate de reconnaissance de forme HemaColor* Merck Coloration de Shorr Sperm Morphostain Nidacon

26 - MORPHOLOGIE - SPERMOCYTOGRAMME

27 CRITERES STRICTES de Kruger-Menkveld

28 Une seule anomalie suffit à classer le sperme comme « atypique »
Classification de Kruger Kruger TF et col (1986). Sperm morphology features as a pronostic factor in in vitro fertilization. Fertil and Steril ; 46 ; Les Anomalies sont répertoriées par ordre d’importance, selon leur emplacement : Une seule anomalie suffit à classer le sperme comme « atypique » CLASSE ANOMALIES DANS LA CLASSE 1-Tête Dimensions, base, acrosome, vacuole 2-Pièce intermédiaire implantation, épaisseur 3-Pièce principale (flagelle) dimentions, linéarité 4-Reste cytoplasmique présence ou absence

29 1 ANALYSE DE LA TETE SPERMOCYTOGRAMME SELON KRUGER : METHODE D’ANALYSE
DES SPERMATOZOIDES

30 1-1 ANALYSE DE LA TETE SPERMOCYTOGRAMME SELON KRUGER :
METHODE D’ANALYSE DES SPERMATOZOIDES

31 1-1 ANALYSE DE LA TETE SPERMOCYTOGRAMME SELON KRUGER :
METHODE D’ANALYSE DES SPERMATOZOIDES

32 1-1 Anomalies de forme de la TETE
SPERMOCYTOGRAMME SELON KRUGER : METHODE D’ANALYSE DES SPERMATOZOIDES L’ACROSOME

33 1-2 ANALYSE DE L’ACROSOME

34 1-1 Anomalies de forme de la TETE
SPERMOCYTOGRAMME SELON KRUGER : METHODE D’ANALYSE DES SPERMATOZOIDES DYSMORPHIES

35 1-1 Anomalies de forme de la TETE

36 1-1 Anomalies de forme de la TETE

37 1-1 Anomalies de forme de la TETE

38 1-1 Anomalies de forme de la TETE

39 1-1 Anomalies de forme de la TETE

40 1-1 Anomalies de forme de la TETE

41 1-1 Anomalies de forme de la TETE

42 1-1 Anomalies de forme de la TETE
SPERMOCYTOGRAMME SELON KRUGER : METHODE D’ANALYSE DES SPERMATOZOIDES VACUOLES

43 1-3 ANALYSE DES VACUOLES

44 1-3 ANALYSE DES VACUOLES

45 1-3 ANALYSE DES VACUOLES

46 1-4 ANALYSE DES VACUOLES

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48 Bedford et al,1973 (microscopie électronique)
V Chromatine : Condensation normale Vacuole + Chromatine : Condensation anormale

49 Bisson et David, 1975 (microscopie électronique)
Présence de : Grosses vacuoles nucléaires Chromatine mal condensée

50 MATURITE NUCLEAIRE Histones ++++ +--- Protamines
spermatides Spz mature Histones ++++ +--- Protamines Compaction Stabilité nucléaire ---- Rapport DNA : Volume total

51 TEST DE MATURITE NUCLEAIRE COLORATION AU BLEU D’ANILINE
HISTONES RICHE EN LYSINE (BLEU) PROTAMINES RICHE EN CYSTEINE peu coloré : MATURES Auger et Eustache 2004 1998, Hamadeh et Coll. Relation entre taux de fécondation, taux de grossesse et test au bleu d’aniline : SPZ colorés en bleu (imâtures) inf. à 30% : Tx fecondation 80%,Tx de grossesse : 53% SPZ colorés en bleu (imâtures) sup. à 30% : Tx fecondation 59%, Tx de grossesse : 30%

52 Base et PIECE INTERMEDIAIRE
SPERMOCYTOGRAMME SELON KRUGER : METHODE D’ANALYSE DES SPERMATOZOIDES Base et PIECE INTERMEDIAIRE

53 1-5 ANALYSE DE LA BASE AXE normal Les Centrioles contribuent à :
- l’organisation des microtubules - la formation du fuseau (syngamie et clivage) AXE normal

54 1-5 ANALYSE DE LA BASE SPERMOCYTOGRAMME SELON KRUGER :
METHODE D’ANALYSE DES SPERMATOZOIDES

55 1-5 ANALYSE DE LA BASE SPERMOCYTOGRAMME SELON KRUGER :
METHODE D’ANALYSE DES SPERMATOZOIDES

56 1-5 ANALYSE DE LA BASE SPERMOCYTOGRAMME SELON KRUGER :
METHODE D’ANALYSE DES SPERMATOZOIDES

57 ANALYSE DE LA PIECE INTERMEDIAIRE
2 ANALYSE DE LA PIECE INTERMEDIAIRE (P.int.) SPERMOCYTOGRAMME SELON KRUGER : METHODE D’ANALYSE DES SPERMATOZOIDES

58 2 ANALYSE de la Pièce intermédiaire
SPERMOCYTOGRAMME SELON KRUGER : METHODE D’ANALYSE DES SPERMATOZOIDES

59 2 ANALYSE de la Pièce intermédiaire

60 2 ANALYSE de la Pièce intermédiaire
RESTE CYTOPLASMIQUE Si > 1/3 de la tête

61 Pièce principale flagelle
SPERMOCYTOGRAMME SELON KRUGER : METHODE D’ANALYSE DES SPERMATOZOIDES Pièce principale flagelle

62 Classe 3 - PIECE PRINCIPALE - flagelle
Flagelle normal : - Droit, ou sinueux - Sans angulation Sans enroulement - 45 µm env. (Soit tête x 10)

63 Pièce principale - flagelle

64 SPERMATOZOIDES ANORMAUX - 5 (1)
Source : OMS, photos C.Brazil

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66 Spermocytogramme Comment effectuer un spermocytogramme selon les critères strictes de Menkveld ? Tête P.Int P. Principale R.Cytopl. Résultats N A - Atyp. oui Typ. A N - Atyp. oui

67 Exemple de Résultats Spermocytogramme
Formes typiques 5 % Formes atypiques 95 % Dont Anomalies : tête 65 % Pièce intermédiaire 55 % Pièce principale 20 % Reste cytoplasmique 25 % Le total du pourcentage des anomies dépasse 100 % À cause des anomalies multiples chez certains SPZ. Intérêt de déterminer le TZI Index de teratozoospermie

68 DIMINUTION DES VALEURS SEUIL DE LA MORPHOLOGIE du SPERMATOZOÏDE
Systeme de classification références MacLeod David OMS 1980 Dusseldorf Menkveld, Kruger OMS OMS 1999 (?) OMS 2010 MacLeod 1964,1970 David et Coll Eliasson 1971 Belsey et Coll. 1980 Hofmann et Coll. 1985 Strict Criteria Kruger et Coll 1986 Menveld et Coll. 1990 2ème et 3ème Editions 4ème Edition 5ème Edition (St. Criteria) DIMINUTION DES VALEURS SEUIL DE LA MORPHOLOGIE du SPERMATOZOÏDE MacLeod David Menkveld Kruger Kruger

69 Les principales causes : - Influence de l’environnement et du mode de vie Agents reprotoxiques et perturbateurs endocriniens - Affinement des classifications proposées - Augmentation des anomalies répertoriées (évaluation de la tête, acrosome, vacuoles) - Utilisation des Critères strictes d’évaluation de la morphologie (Kruger, Menkveld…)

70 SPERMOCYTOGRAMME SPERMOCYTOGRAMME (5ème édition : OMS 2010)
G. DAVID et Coll 1974 /88/90 SPERMOCYTOGRAMME (5ème édition : OMS 2010) MENKVELD-KRUGER Plus descriptive moins reproductible plutôt francophone Plus réaliste (FIV/ICSI) plus reproductible Automatisable Internationale 1974 publ. Originale 1988 ajout IAM 1990 ajout acrosome Vacuoles ??

71 Menkveld : Tygerberg Hospital potentiel de % classe grossesse
Comment interpréter les résultats du spermocytogramme en dehors des valeurs-seuil ? Menkveld : Tygerberg Hospital potentiel de % classe grossesse naturelle < 4 % « infertile » rare 5 -15 % « subfertile » réduit > 15 % « fertile » optimal

72 Le SPERMOCYTOGRAMME TZI : index de teratozoospermie

73 le TZI Index de teratozoospermie
Spermocytogramme le TZI Index de teratozoospermie Menkveld et Coll., Human Reprod., 16 : Index conseillé en cas teratospermies sévères C'est le nombre moyen d'anomalie (de classe) par SPZ anormal Tête : classe A P.intermediaire : classe B P.principale : classe C Reste cytoplasmique : classe D Le calcul du TZI est alors N(a) +N(b) + N(c) +N(d) SPZ atypiques observés (TZI max théorique = 4)

74 le TZI Index de teratozoospermie
Spermocytogramme le TZI Index de teratozoospermie Menkveld et Coll., Human Reprod., 16 : Valeurs-seuil In vivo : < 1,46 In Vitro : < 1,64 Rowe et coll (2000) donne cet exemple : Avec 4% de formes normales Un TZI < 1, peut orienter vers une FIV Un TZI > 1, doit orienter vers une ICSI

75 Spermocytogramme Apport de l’observation des spermatozoïdes à gros grossissement (X6600) dans le choix des spermatozoïdes en vue d’ICSI

76 - Observation de toutes les faces du spermatozoïde en mouvement
- Pas d’artefact dû à la coloration sur Lame - Meilleure définition de la forme de la tête - Observation de l’acrosome et de l’importance des vacuoles - Permet de mieux appréhender leur morphologie qu’à plus petit grossissement (X400, X600, X1000)

77 Cette observation peut aider au choix de la technique d’AMP
À mettre en œuvre : FIV, ICSI ou IMSI Son application en ICSI peut être « un Plus appréciable »

78 Interprétation des résultats

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80 Comment rendre les résultats ?
Nomenclature : Normospermie, oligospermie, OATS…. ? OU renseignement clinique en potentiel de fertilité : infertile : chances de grossesse réduites subfertile : chances de grossesse modérées Fertile : chance de grossesse optimales

81 Casablanca 09/2015 Fivfrance 2015 fivfrance