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1 FivFrance Formation

2 LE SPERME HUMAIN ANALYSE DE PREMIÈRE INTENTION

3 SPERMIOLOGIE DE PREMIÈRE INTENTION
Introduction

4 L’analyse du sperme Le sperme est : Difficile a analyser
Difficile à interpréter (en terme de fertilité) Difficile à améliorer in vivo Cette analyse ne permet pas d’approcher les processus d’interaction spermatozoïde/ovocyte

5 Difficile à analyser Les techniques d’analyse du sperme demandent des connaissances et un savoir faire particuliers Résultats « sujet-dépendants » - Coefficients de variation importants entre 2 manipulateurs D’où l’importance de procédures strictes et bien définies pour rendre des résultats crédibles et interprétables - Nécessité d’un Contrôle de Qualité intra et inter laboratoires

6 Difficile à interpréter
Dans de nombreux cas : Grandes variations d’un spermogramme à l’autre chez un même patient. -> Nécessité de faire plusieurs analyses dans le temps pour conclure Il n’existe Pas toujours de relations étroites entre les résultats trouvés et la fertilité du couple : - Au dessus de 10 millions/ml -> pas de relations entre fertilité et nombre de SPZ, En dessous : oui - Relation entre mobilité dite flèchante » et fertilité : oui

7 Difficile à interpréter
Difficulté de définir des valeurs usuelles normales qui contiennent l’ensemble des cas « fertiles » On préfère utiliser la notion de « valeurs-seuil » choix du 5eme percentile - (OMS 5ème édition) Liens entre anciennes et nouvelles notion de normalité ( avant et après 2010)

8 Difficile à Améliorer Peu ou pas de traitements efficaces pour améliorer significativement La qualité du sperme dans les cas suivants : - OATS - AC. ANTISPERMATOZOIDES - (INFECTIONS HAUTES) D’où l’importance croissante des techniques d’AMP : IIU, FIV, ICSI, ..avec ou sans recours à une ponction épididymaire ou testiculaire.

9 LES ELEMENTS DU COMPTE-RENDU DE RESULTATS EN SPERMIOLOGIE de première intention

10 Date et heure du recueil : Délai d’abstinence (j) :
Conjoint : Nom, Prénom, D.N Conjointe : Adresse : Médecin prescripteur : Date et heure du recueil : Délai d’abstinence (j) : SPERMOGRAMME Mobilité totale % Mobilité flêchante % Mobilité Progressive % Immobile % Vitalité % ______________________ Agglutinats + ou - Mar-test % Volume : (ml) pH : (UpH) Viscosité : norm. aug. Forte Aspect : Conc SPZ : millions/ml Num SPZ : millions/éjaculat Polynucléaires : millions/ml Cell.rondes : millions/ml

11 Date et heure du recueil : Délai d’abstinence (j) :
Conjoint : Nom, Prénom, D.N Conjointe : Adresse : Médecin prescripteur : Date et heure du recueil : Délai d’abstinence (j) : SPERMOCYTOGRAMME Nbre SPZ observés : Spz typiques : % Spz atypiques : % Anomalies de : Tête : % P.Intermédiaire : % P.Principale : % R.Cytoplasmique : % Index de teratozoospermie (TZI) : Divers Flagelles isolés : SPZ en lyse : Autres Cellules : (macrophages,cell. épithéliales…) CONCLUSION :

12 EXAMENS COMPLEMENTAIRES
Conjoint : Nom, Prénom, D.N Conjointe : Adresse : Médecin prescripteur : Date et heure du recueil : Délai d’abstinence (j) : EXAMENS COMPLEMENTAIRES Agglutinats + à ++++ MAR-TEST Ou Test IMMUNO-BILLES SPERMOCULTURE Systématique ?

13 Définitions des différentes défaillances :
Normospermie ou normozoospermie : Sperme dont toutes les constantes sont dans les normales usuelles Aspermie : Absence de sperme (penser à Ejaculation rétrograde ou hypospadias) Termes nuancés (Hypospermie-hyperspermie) Azoospermie : Absence de SPZ dans le sperme, même après enrichissement par centrifugation Cryptozoospermie : Absence de SPZ dans le sperme à l’examen direct, mais présence (faible) après centrifugation

14 Définitions des différentes défaillances (suite) :
Oligospermie ou oligozoospermie : Numération < val.usuelles Asthénospermie : defaillance de la mobilité Teratospermie ou teratozoospermie : % formes typiques < val.usuelles Possibité de defaillances multiples : OATS : Oligo-Asthéno-Terato-zooSpermie Nécrospermie : Nombreux SPZ immobiles avec un % de SPZ vivants faible (vitalité) : causes toxiques ou préservatifs ??? Leucospermie : Leucocytes ++ (sperme légèrement coloré en jaune) Hémospermie : Hématies ++ (sperme légèrement coloré en brun ou rosé)

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16 CAUSES D’INFERTILITES D’ORIGINE MASCULINE
Les Anomalies de nombre, de mobilité, de morphologie - OATS - Cryptozoospermie - Azoospermie (secrétoire ou excrétoire) - Nécrospermies, syndrome de Kartagener (flagelle) Autres causes - Infertilités d’origine infectieuse - Présence d’auto-Anticorps anti-spermatozoïdes - infertilités d’origines toxique ou environnementale - Fragmentation de l’ADN, Anomalie du caryotype Causes d'ordre constitutionnelle ou aquise - Hypospadias, cryptorchidie, Varicocèle - Ejaculation rétrograde

17 INFERTILITES D’ORIGINE MASCULINE les plus couantes
- Hypospadias, cryptorchidie, Varicocèle

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19 LES CONDITIONS DE RECUEIL DU SPERME AU LABORATOIRE

20 LE RECUEIL DU SPERME AU LABORATOIRE - Au Laboratoire,
(Exceptionnellement à Domicile (sauf pour les IIU) -> Retour au laboratoire : avant 1/2 heure, à l’abri de la lumière à température de 20 à 30°C) Noter l’heure du recueil - Respect du délai d’abstinence (2 à 4 jours)- 1J. Si ADN Fragm. 1 Miction avant recueil (boire les 2-3 jours précédents) 2 Nettoyage des mains et des ongles, séchage des mains avec une serviette papier à usage unique 3 Toilette intime avec savon liquide et rinçage abondant à l’eau 4 Recueil par masturbation 5 Le coït interrompu n’est pas possible : contamination par germes vaginaux, pH acide du vagin, perte de la première miction (la plus importante).

21 LA SALLE (idéale) DE RECUEIL DU SPERME
Doit être isolée du reste du laboratoire ou avec un SAS Ne doit pas donner directement sur la salle d’attente Doit être prévue pour recevoir le couple, si demande expresse Doit avoir les commodités suivantes : Une porte à verrou une ventillation forcée efficace Une banquette à revêtement synthétique lavable Un vestiaire ou un porte manteau Un urinoire (pas de WC) Un lavabo à bonne hauteur (lavage des mains et de la verge) Un robinet automatique à détection infrarouge ou à pédale Du consommable à usage unique ou en distributeur

22 Avant le recueil, une explication orale de la procédure de recueil du sperme ferait baisser les prélèvements positifs de moitié, par rapport à une Procédure écrite en salle de recueil. (P. Boucher et Coll – N = 56)) Procédure Par affichage (52) Par oral (52) Cultures contaminées p = 0.016 50% 13% Cultures stériles p = 23% 60% Cultures positives (NS p = 0.09) 27%

23 Exemple de plan de salle de recueil du sperme

24 Récipient de recueil Ouverture large Gradué, stérile rayon gamma Préservatif spécial sans spermicide

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26 LE LABORATOIRE D’ANALYSES DU SPERME EN ROUTINE

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28 Séchage des lames a 56°C le sperme est tué
Coloration comptage

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30 COMPOSITION et CARACTERISTIQUES
DU SPERME

31 Tractus uro-génital Le sperme est constitué, d’une part, d’une suspension concentrée de SPZ baignant dans un liquide épididymaire, et, d’autre part, de différentes sécrétions complexes provenant des organes annexes : Vésicules séminales, (glandes de Cowper), Prostate. Le liquide spermatique est constitué approximativement de : 65% en provenance des vésicules séminales 30% en provenance de la prostate et des glandes de Cowper (> 1%) 5% en provenance des sécrétions épididymaires

32 CARACTERISTIQUES DES DIFFERENTES SECRETIONS
Dans un premier temps (contraction musculeuse prostatique) les spermatozoïdes, dilués dans le liquide prostatique donnera une suspension riche en spermatozoïdes à pH acide. pH = 6,4 Aussitôt après, (contraction secondaire) La sécrétion des vésicules séminales se fera en dispensant un liquide pauvre en spermatozoïdes en pH alcalin. pH = 8,2 Le résultat final donnera un mélange blanchâtre et opalescent de sécrétion à pH neutre contenant la totalité des SPZ. Le volume normal se situera entre 2 et 4 ml. (OMS 2010 : valeur basse 5e percentile : 1,5 ml) Et le pH sup à 7,2 UpH (N:7,4) On cherchera les causes possibles à toute variation du volume ou du pH.

33 MARQUEURS DES DIFFERENTES SECRETIONS
EPIDIDYME (L-carnitine) Alpha glucosidase OMS 2010 N : >ou= à 20 mU/Ej. PROSTATE Sécrétion acide pH 6,4 (Phosphatases acides) Acide citrique Zinc N : >ou= à 52 mol/Ej. N : >ou= à 2,4 mol/Ej. VES. SEMINALE Sécrétion alcaline pH 8,2 Fructose N : > ou= à 13 mol/Ej.

34 Azoospermies obstructives causes possibles
MARQUEURS DES DIFFERENTES SECRETIONS Devant une diminution du volume de l’éjaculat associée à une chute des paramètres spermatiques : Une Biochimie des marqueurs spermatiques pourra aider au diagnostic d’obstruction (effondrement d’un marqueur en aval de l’obstruction) Epididymes Alpha-glucosidase Vesicules Séminales Fructose Prostate Citrate, Zn FSH Azoospermies obstructives Nul ou traces Normal N Occlusion C. Déférents Ou ABCD Et/ou epididymaire Obstruction Niveau : rété testis Azoospermies obstructives causes possibles

35 ABCD AGÉNÉSIE BILATÉRALES DES CANAUX DÉFÉRENTS
MARQUEURS DES DIFFERENTES SECRETIONS ABCD AGÉNÉSIE BILATÉRALES DES CANAUX DÉFÉRENTS Agénésie bilatérale des canaux déférents (ABCD) : une absence des canaux déférents couplée à une Absence des vésicules séminales : Azoospermie + volume spermatique faible + ph < 7 + Fructose et alpha glucosidase effondrés

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37 Caractéristiques du sperme OBSERVATION DIRECTE du SPERME APRES LIQUEFACTION à 37°C

38 Date et heure du recueil : Délai d’abstinence (j) :
Conjoint : Nom, Prénom, D.N Conjointe : Adresse : Médecin prescripteur : Date et heure du recueil : Délai d’abstinence (j) : SPERMOGRAMME Mobilité totale % Mobilité flêchante % Mobilité Progressive % Immobile % Vitalité % ______________________ Agglutinats + ou - Mar-test % Volume : (ml) pH : (UpH) Viscosité : norm. aug. Forte Aspect : Conc SPZ : millions/ml Num SPZ : millions/éjaculat Polynucléaires : millions/ml Cell.rondes : millions/ml

39 1 - Faire les Ensemencements pour SPERMOCULTURE 2 - Mesure du volume (en ml.) Directement ++(+) Après transfert dans un tube gradué (perte 10-15%) Par double pesée +++ Recommandée ? 3 - Appréciation de la couleur et de la Viscosité (hémospermie – leucospermie)

40 APPRÉCIATION DE LA VISCOSITÉ TEMPS NORMAL DE LIQUÉFACTION A 37°C : MINUTES EVALUATION DE LA LIQUEFACTION : VISCOSITÉ NORMALE LE SPERME SORT DE LA PIPETTE GOUTTE A GOUTTE VISCOSITÉ AUGMENTÉE LE SPERME SORT DE LA PIPETTE EN TRAINÉE DE 1-2 CM PAS DE LIQUÉFACTION : LE SPERME RESTE COAGULÉ, IMPOSSIBLE A PIPETER

41 SPERME HYPERVISQUEUX : TRAITEMENT AVANT ANALYSE : 1 – DILUTION AVEC UN MILIEU TAMPONNÉ PHYSIOLOGIQUE PUIS PASSAGES RÉPÉTÉS DU MÉLANGE DANS UN AIGUILLE FINE MONTÉE SUR UNE SERINGUE A JETER 2 – UTILISATION DE LA BROMÉLINE (PROTÉASE) FAIRE UNE SOLUTION DE BROMÉLINE À 10 UI/ML DANS UNE SOLUTION TAMPON PHOSPHATE DE DUBELCO (AGITER 15 A 20 MINUTES) - MELANGER LE SPERME VOLUME À VOLUME AVEC LA SOL. DE BROMELINE - FAIRE PLUSIEURS PASSAGES DANS UN PIPETTE FINE. - TENIR COMPTE DE LA DILUTION (1/2)

42 SPERME HYPERVISQUEUX : CE TRAITEMENT AURA UNE INCIDENCE SUR L’APPRÉCIATION DE PRATIQUEMENT TOUS LES PARAMETRES : EN PARLER DANS LA CONCLUSION

43 Principales causes d’anomalies du VOLUME
Volume bas inférieur à 1,5 ml. Recueils incomplets Agénésies des vésicules séminales Obstructions du canal éjaculateur Ejaculations rétrogrades (rech. de SPZ dans les urines) Volume élevé supérieur à 6 ml. Abstinence longue Varicocèle Infection des glandes annexes (vésicules. Séminales, prostate)

44 Principales causes d’augmentation de la viscosité
- Augmentation du temps de liquéfaction - Augmentation de la viscosité -> pas de liquefaction - Dysfonctionnement de la prostate - Diminution des protéases affectées à la liquéfaction de l’éjaculat (proteolysine, proteogénase)

45 Principales causes d’anomalies de pH spermatique
pH augmenté - Recueil incomplet : 1ere fraction absente - Dysfonctionnement prostatique - Attente trop longue avant sa mesure pH diminué - Dysfonctionnement vésiculaire - Agénésie vésiculo-déférentielle (ABCD) - Obstacle du canal éjaculateur - Recueil incomplet : derniere(s) fraction(s) absente(s)

46 ANALYSES SUR SPERME LIQUÉFIÉ

47 4 - Homogénéisation (par passage dans pipette pasteur par ex.)
5 - Prise du pH (1 goutte sur papier pH à prendre entre 30 et 60 mn après le recueil.- le pH augmente avec le temps) 3 - Observation sous microscope (à 37°C) : microlitres entre lame et lamelle de 22 x 22 mm - X200 ou X Recherche d’agglomérats et/ou d’agglutinats immunologiques ? - Appréciation de la richesse en cellules « rondes  » leucocytes(?), cellules de la lignée germinale, cellules épithéliales Appréciations de la richesse en spermatozoïdes pour préparer les dilutions avant comptage (voir chapitre numération) - Appréciation globale de la mobilité

48 Si suspicions de la présence D’auto-anticorps anti-SPZ :
Agglutination immunologique : caractéristiques Agglutinats de quelques spermatozoïdes donnant des images Caractéristiques selon l’emplacement des auto-AC sur les SPZ Agglutinats augmentant au cours du temps Tête Queue T+Q T = x T = X + 50 mn Si suspicions de la présence D’auto-anticorps anti-SPZ : Pratiquer : un Mar-test ou IBT

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50 Date et heure du recueil : Délai d’abstinence (j) :
Conjoint : Nom, Prénom, D.N Conjointe : Adresse : Médecin prescripteur : Date et heure du recueil : Délai d’abstinence (j) : SPERMOGRAMME Mobilité totale % Mobilité flêchante % Mobilité Progressive % Immobile % Vitalité % ______________________ Agglutinats + ou - Mar-test % Volume : (ml) pH : (UpH) Viscosité : norm. aug. Forte Aspect : Conc SPZ : millions/ml Num SPZ : millions/éjaculat Polynucléaires : millions/ml Cell.rondes : millions/ml

51 1ere Constatation : GRANDE VARIATION PHYSIOLOGIQUE DE LA NUMERATION
NOMBRE CONCENTRATION

52 2ème Constatation : GRANDES VARIATIONS APRES ABSTINENCE

53 Comptage des spermatozoïdes - Sous microscope - X 200 ou X 400
La NUMERATION S’exprime en - Nbre de SPZ en millions par ml. (concentration) - Nbre de SPZ en millions par éjaculat Comptage des spermatozoïdes - Sous microscope - X 200 ou X 400 1 - Observation simple sans colorant (-) 2 - Observation Après coloration au bleu (++) 3 - Observation en contraste de phase (+++)

54 1 - Homogénéisation de l’échantillon
PROCEDURE 1 - Homogénéisation de l’échantillon 2 - Estimer la concentration en SPZ de l’échantillon 2 - Dilution dans un liquide approprié : - au 1/50 (v/v) au 1/20 (v/v) - au 1/5 (v/v) dans les oligospermies - au 1/2 (v/v) dans les oligospermies sévères Tampon de dilution sans colorant (lecture en contraste de phase) Bicarbonate de Na g Formaldéhyde à 35%(v/v) ml Eau distillée QSP ml. Conserver à 4°C. Tampon de dilution avec colorant (lecture microscopique normale) Bleu trypan (CL Merck) ,25 g Bicarbonate de Na g Eau distillée QSP ml. Conserver à 4°C. (filtration eventuelle ) Tampon de dilution avec colorant (lecture microscopique normale) (CL Merck) ,25 g Bicarbonate de Na g Formaldéhyde à 35%(v/v) ml Eau distillée QSP ml. Conserver à 4°C. (filtration eventuelle )

55 Estimation de la concentration en SPZ
10 l de sperme homogénéisé entre lame et lamelle (22x22 mm) Epaisseur de l’échantillon 20 m app. Avec OBJ. X40 et OCC. X10, ouverture 20 mm (volume vu = 4 nl.) Avec OBJ. X20 et OCC. X10, ouverture 20 mm (volume vu = 16 nl) X 400 Nbre SPZ par champs X 200 Nbre SPZ par champs Dilution > 101 > 404 1/20 e 16-100 64-400 1/10 e 2-15 8-60 1/5 e < 2 < 8 1/2 e

56 Les Cellules de comptage

57 Cellules de comptage multi-usage
SIMPLE OU DOUBLE LECTURE Cellule de MAKLER CELLULES KOVA à usage unique

58 Cellules de MALASSEZ 1 grand rectangle rouge = 100 rectangles bleus = 1 mm3 10 rectangle bleus = 0,1 mm3 1 rectangle bleu = 0,01 mm3 EXEMPLE : sperme dilué au 1/50e comptage de 40 spz dans 10 petits rectangles, soit 40 spz/0,1 mm3, soit 400 spz dans 1 mm3 Soit spz/ml > x 50 = / ml.

59 Comptage : Cellule NEUBAUER IMPROVED BRAND*
Fond metallique - Déposer le sperme dans la cellule (10 ou 20 l) Recouvrir d’une lamelle ad hoc (plane) Laisser sédimenter 5-6 minutes (chambre humide) - Compter

60 Utiliser les 2 cellules de comptage
25 grands carrés De 16 petits carrés chacun Non Oui Utiliser les 2 cellules de comptage pour faire la moyenne (diff>10%) Compter au moins 200 spz/cellule 16 carrés = 4 nl

61 COMPTAGE 25 grands carrés 1 + 4 1/5 e 20 8 4 1 + 9 1/10 e 10 2 1 + 19 1/20 e 5 1 1 + 49 1/50 e 0,8 0,4 Sperme- Diluant dilution Comptage sur Comptage sur Comptage sur 25 grands carrès grands carrès grands carrés Fact.conversion Fact.conversion Fact.conversion Exemple dilution du sperme : 1/20 e : 220 SPZ sur 10 grands carrés Résultats en millions/ml = 220 : 2 = 110 millions/ml.

62 Le comptage se fait sur spermatozoïdes morts
COMPTAGE EN CELLULE KOVA Le comptage se fait sur spermatozoïdes morts (10 mn à 56 °C ou dilué dans une solution physiologique formolée par ex.

63 - soit 6,5 ul

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65 EXEMPLE : Sperme dilué au 1/50e
Comptage de 220 SPZ dans 5 carres jaunes : soit 220 X 9/5 = 396 spz /mm3 soit spz/ml X 50 (dilution) = spz/ml

66 COMPTAGE EN CELLULE DE MAKLER*
Sur spermatozoïdes morts, non dilués : Obervation x 200 D’avantage utilisée dans les labo d’AMP pour faire une estimation rapide en LABM, si elle est utilisée, il faut le faire avec le sperme liquéfié, dilué ou non et chauffé 5 minutes à 60 °C. Déposer 7µl de sperme sur la cellule, après avoir pris soin de bien mélanger le sperme (Vortex). •Poser dessus la lamelle ronde et tourner celle-ci sur le sperme pour qu’il s’étale uniformément (arc-en-ciel sur les bords). Le volume de la grille est de 1mm x 1mm x 10µm (Hauteur) soit 0.01mm3.

67 Le comptage se fait sur spermatozoïdes morts
COMPTAGE EN CELLULE DE MAKLER Le comptage se fait sur spermatozoïdes morts (10 mn à 56 °C ou dilué dans une solution physiologique formolée par ex. Compter les SPZ dans 10 carreaux donne directement la numération en millions/ml Vérifier la bonne répartition des SPZ avant lecture. Diluer si besoin

68 NUMERATION DES CELLULES RONDES
Cellules de la lignée germinales : Spermatides Spermatocytes … ____________ Polynucléaires, Monocytes, Macrophages ____________ En règle générale, un éjaculat normal contient moins de 5 millions de cellules ronde/ml et le nombre de leucocytes est inférieur à 1 million/ml En cas d’infection Le comptage des polynucleaires se fera, à part, avec un reactif spécifique revelant les cellules à peroxydase +.

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70 Cas particulier : L’AZOOSPERMIE

71 AZOOSPERMIE Se définie comme la constance dans le temps, d’une absence totale de spermatozoïdes A l’examen direct et après enrichissement par centrifugation. AZOOSPERMIE SECRETOIRE Se définie comme une absence de production de spermatozoïde AZOOSPERMIE EXCRETOIRE Se définie comme un blocage de l'émission des spermatozoïdes malgré leur production

72 SECRETOIRE pas de production EXCRETOIRE production sans émission
AZOOSPERMIE Se définie comme la constance dans le temps, d’une absence totale de spermatozoïdes A l’examen direct et après enrichissement par centrifugation. Azoospermie SECRETOIRE pas de production EXCRETOIRE production sans émission FSH > N - (N??) N Inhibine - AMH < N (C.Sertoli) Marqueurs BIO Quasi N Éffondrés (1 ou + ?) SPM : Cell.Lignée SP. possible non Biopsie, rech SPZ - à --+ + à +++

73 Interrogatoire (clinicien) - Examen clinique (clinicien)
Exploration de l’AZOOSPERMIE Interrogatoire (clinicien) - Examen clinique (clinicien) - Examens biologiques - En dernier ressort : biopsie testiculaire

74 L’apport de la BIOLOGIE
Spermogramme(s) Ne pas confondre azoospermie et cryptozoospermie Fonder son diagnostic sur plusieurs spermogrammes Marqueurs biochimiques du sperme Azoospermie excetoire : repérage du lieu de rétention Dosages hormonaux FSH (Cellule de Sertoli Axe hypothalamo-hypophysaire) Az. secrétoire FSH augmentée (ou normale ???) Az. secrétoire à FSH abaissée : hypogonadisme hypogonadrotrope Az. excrétoire FSH normale

75 Exploration génétique
ABCD : Si l'anomalie est obstructive congénitale avec agénésie épididymo déférentielle (considérée comme une forme mineure de mucoviscidose). Caryotype sanguin + géne CFTR (mucoviscidose) Si l'anomalie est sécrétoire, si besoin : Recherche de micro-délétions sur le bras long du chromos. Y (gênes AZ F,a,b,c). Avec enquête dans la Fratrie

76 BIOPSIE TESTICULAIRE A manipuler avec précautions :
- Prévoir en même temps une ICSI en parallèle Car : Dans 1/3 des cas, Le prélèvement de fragments testiculaires permet d’obtenir des spermatozoïdes utilisables en AMP. D'après certains auteurs, La cryopréservation de la biopsie, en 1ère intention amène un taux important de fausses couches spontannées. La biopsie n'est pas un geste répétitif anodin : Risque de fibrose post-opératoire ou d’une dégradation subite d’une spermatogenèse déjà anecdotique.

77 UNE SOLUTION D’AVENIR ? LA DIFFÉRENTIATION IN VITRO DES CELLULES SOUCHES GERMINALES Indications Les indications de la technologie de thérapie cellulaire Artistem® concernent des patients qui ont des cellules souches germinales mais ne produisent pas de spermatozoïdes:   Les enfants pré-pubères :  • soumis à des traitements gonado-toxiques (chimio et radiothérapies) : les traitements peuvent entrainer une stérilité, •  opérés suite à une cryptorchidie bilatérale, • demandeur d’une greffe de moelle osseuse   Les patients adultes atteints d’une azoospermie non obstructive liée à une déficience somatique.

78 2 CULTURE DES CELL. GERMINALES
1 BIOPSIE DE PULPE TESTICULAIRE. + CONGÉLATION 2 CULTURE DES CELL. GERMINALES (72 JOURS) CONGÉLATION DES SPZ OBTENUS 3 FÉCONDATION IN VITRO PAR MICROINJECTION

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80 EVALUATION DE LA MOBILITE DES SPERMATOZOIDES

81 Computer-aided sperm analysis
Dans l’analyse du sperme, c’est l’évaluation La plus subjective qui demande une grande habitude Le coefficient de variation inter-techniciens Reste élevé Des analyseurs d’images (CASA) peuvent être utilisés Computer-aided sperm analysis

82 EVOLUTION DU RENDU DES RESULTATS
fff fivfrance formation EVOLUTION DU RENDU DES RESULTATS OMS 1999 OMS 2010 Grade a : progressifs rapides > 25 mcM/sec Grade b : Progressifs lents < 20 mcM/sec Grade c : Non Progressifs < 5 mcM/sec Grade d : mobiles sur place Valeurs usuelles : Grade a+b : > 50 % Ou Grade a : > 25% Dans l’heure qui suit l’éjaculation Mobiles Totaux a,b,c,d) % Mobiles Progressifs (a,b) % Normales : Mobiles totaux (a,b,c,d) > 40 % Mobiles progressifs (a,b) > 32 %

83 Spermiologie de première intention
(5ème édition : OMS 2010) La cause invoquée : Manque de reproductibilité de lecture (inter et intra observateur) Selon le SIGA ( Special Interest Group for Andrology - ESHRE) Il semble dommageable d’abandonner ce paramètre discriminant :  Les spz flêchants sont plus aptes à traverser la glaire cervicale et a féconder l’ovocyte in vivo - Aitken et Coll Mortimer et coll, Comhaire et Coll, 1986, - Baratt et Coll 1992 Mêmes constatations - en IIU - (Irvine, Aitken, bollendorf et Coll, 1996) - en FIV - Bollendorf et Coll, Sifer et Coll, 2005) - en ICSI : VSL (straight line velocity) Vitesse progressive linéaire a été corrélée au taux de fécondation - M. Van Den Bergh et Coll. 1998

84 Spermiologie de première intention
(5ème édition : OMS 2010) - Formation du personnel de laboratoire pour une meilleure homogénéité des Résultats - Analyseur cinétique : système CASA Computer Assisted Sperm Analysis

85 EVALUATION DE LA MOBILITE, sous Microscope Optique
Elle s’effectue : - Après liquefaction et homogénéisation extemporannée du sperme (entre 30 et 60 mn après le recueil) Lecture à 37°C Déposer 10 l. De sperme homogénéisé sur une lame et recouvrir avec une Lamelle de 22 X 22 mm de manière à obtenir une profondeur de 20 m. Approximativement. La lecture se fera vers le centre de la lamelle pour éviter les courants de convection qui pourrait fausser l’appréciation du mouvement. 25 m/sec = trajet de la longueur d’un SPZ én 2 secondes

86 Evaluation de la Mobilité
A > 25 mcm/s. Linéaire-flêchant B < 25 mcm/s Non linéaire. C < 5 mcm/s. D = 0 mcm/s Sur place a a d b d c

87 EVALUATION DE LA MOBILITE - C.A.S.A
1 logiciel de reconnaissance cinétique 1 PC avec écran plat, Une camera vidéo Principe : Recherche et reconnaissance des têtes de spermatozoïdes (contraste + taille) Mise en mémoire des coordonnées (X-Y) des têtes Répétition de l’analyse image après image Liaison des différentes coordonnées X-Y Construction des trajectoires de chaque tête analysée - synthèse Légende VCL vitesse curvilinéaire (en m/sec.) VSL vitesse de progression linéaire VAP vitesse sur la trajectoire moyenne ALH amplitude deplac.latérale de la tête LIN linéarité de la trajectoire :VSL/VCL STR rectitude :VSL/VAP BCF fréquence de croisement de la trajectoire : battements/sec. WOB oscillation (VAP/VCL)

88 HYPERACTIVITE – CAPACITATION -Inhibition de la capacitation Les polyamines prostatiques (la spermine) inhibent, par des effets de stabilisation membranaire, certains des processus impliqués dans la capacitation et la réaction acrosomique

89 MOUVEMENTS HYPERACTIFS : LAVAGE DES SPERMATOZOÏDES : Elimination du liquide spermatique Modification des mouvements du sperme (hyperactivité) Réaction Acrosomique °°° Etat transitoire

90 Sperme frais Après 30 minutes à 37°C

91 Sperme en capacitation
Apres traitement pour IAC

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93 VITALITE DES SPERMATOZOIDES

94 Pourquoi évaluer la Vitalité ?
1 – C’est un bon contrôle de l’évaluation de la MOBILTITE : % de SPZ morts < ou = % de SPZ immobiles % de SPZ vivants > ou = % de SPZ mobiles Le sperme vivant possède une « membrane  réactive » - Réagit aux colorants en empêchant leur entrée passive à l’intérieur (test à l’éosine-nigrosine) - Réagit à des différences d’osmolarité en régulant le passage d’eau (HOS test - Hypo Osmotic Swelling Test) 2 - En cas d’IMMOBILITÉ TOTALE des SPZ, c’est le moyen de savoir si certains sont vivants (test de Hos associé à la technique d’ICSI)

95 Orientation diagnostique ?
La présence d’un grand % de spermatozoïdes immobiles et vivants peut évoquer un défaut structurel du flagelle. La présence d’un grand % de spermatozoïdes immobiles et Morts peut évoquer une pathologie au niveau de l’épididyme.

96 Résultats en % spz vivants et morts - comptage sur 100 SPZ
COLORATION A L’EOSINE-NIGROSINE Reactifs commerciaux : VITALSCREEN* (Fertipro) ou VITALSTAIN* (Nidacon) Résultats en % spz vivants et morts - comptage sur 100 SPZ

97 fff fivfrance formation
Spermiologie de première intention (5ème édition : OMS 2010) La Vitalité Permet de quantifier TOUS les spermatozoïdes VIVANTS Mobiles ou immobiles La valeur seuil passe de 50 à 58 % Pourquoi ? Question de convention Tout degré de coloration rose (passage de l’éosine) représente Un spermatozoïde mort WHO 2010 : Tête « rose clair » considérée Comme vivant Erreur à corriger !

98 HOS TEST VIVANTS MORT Résultats en % spz vivants et morts - comptage sur 100 SPZ ou utilisable directement en ICSI

99 2015 Fivfrance