Titre Purification des protéines.

Présentation au sujet: "Titre Purification des protéines."— Transcription de la présentation:

1 Titre Purification des protéines

2 plan * 1. Principe. * 2. Préparation d'un extrait brut.
* 3. Purification. * 4. Révélation.

3 Plan 3.1-2 * 3. Purification. 3.1. Techniques de précipitation.
* Solvants organiques. * Solution saline. * Variation de pH. * 3. Purification. 3.2. Séparation par une membrane. Dialyse. Ultra-filtration.

4 Plan 3.3 * 3. Purification. 3.3. Chromatographies. * 3.3.1. Principe.
Performance d'une colonne. * Efficacité. * Sélectivité. * Résolution. * Chromatographies "classiques". * Échange d'ions. * Filtration sur gel. * Chromatographie d'affinité. * Utilisations successives.

5 Plan 3.4 * 3. Purification. 3.4. Electrophorèse.
3.3. Chromatographies. * Principe. * Principe. Performance d'une colonne. Types d’électrophorèses. * Efficacité. * Electrophorèses en veine liquide. * Sélectivité. * Electrophorèses sur support. * Résolution. * Chromatographies "classiques". Electrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE). * Échange d'ions. * Préparation du gel. * Filtration sur gel. * Conditions dénaturantes. * Chromatographie d'affinité. * Utilisations successives.

6 A chaque étape correspond un rendement:
La purification des protéines passe par plusieurs étapes de spécificité croissante. Plan 1 principe * 1. Principe. A chaque étape correspond un rendement: Rdt = m purif m départ cellule membrane Broyage centrifugation noyau fraction cellulaire mitochondrie gel filtration cytoplasme chromatographies lipides fraction biochimique enzyme spécifique protéines ADN / ARN électrophorèse

7 2.1 extrait 2.1. Isolement cellulaire.
* 2. Préparation d'un extrait brut. filtration cellules culture cellulaire milieu de culture

8 2.2 extrait 2. Préparation d'un extrait brut. 2.2. Extraction.
2.1. Isolement cellulaire. 2.2 extrait mécanique broyage (paroi cellulosique des végétaux) chimique solutions alcalines (membranes des cellules animales) enzymatique lysozyme (paroi bactérienne) DNase (évite la gélification du milieu par libération d’ADN) choc osmotique Protéinase K (protéase)

9 2.3 extrait 2. Préparation d'un extrait brut. 2.2. Extraction.
2.3. Séparation. 2.3 extrait La centrifugation est une méthode particulièrement bien adaptée. A ce niveau, la purification est encore « grossière ». mécanique broyage (paroi cellulosique des végétaux) aiguille de gauge chimique solutions alcalines (membranes des cellules animales) enzymatique lysozyme (paroi bactérienne) DNase (évite la gélification du milieu par libération d’ADN)) choc osmotique Protéinase K (protéase)

10 2.3 centri 2. Préparation d'un extrait brut. 2.3. Séparation.
La centrifugation est une méthode particulièrement bien adaptée. A ce niveau, la purification est encore « grossière ». Il existe deux paramètres qui agissent sur le pouvoir de séparation: en rpm Elle permet de mesurer l’accélération g (à l’aide du diamètre du rotor) La vitesse de rotation Quel est l’intérêt de ces deux méthodes ? centrifugation « classique » sur gradient de saccharose centrifugation zonale Le type de milieu centrifugation isopycnique sur gradient de césium centrifugation à l’équilibre

11 2.3 centri 2. Préparation d'un extrait brut. 2.3. Séparation.
Le pouvoir de séparation d’une centrifugation est meilleur à vitesse faible. Ce n’est pas sans inconvénient: plus la vitesse est faible, plus la durée de centrifugation est longue (elle peut prendre plusieurs heures). plus la durée est longue, plus la diffusion est importante -----> les zones de sédimentation s'étalent et se superposent. -----> les fractions recueilles dans le culot ont tendance à se mélanger. Quel est l’intérêt de ces deux méthodes ? L’utilisation d’un gradient permet d’augmenter le pouvoir de séparation sans diminuer la vitesse de rotation. centrifugation « classique » sur gradient de saccharose centrifugation zonale centrifugation isopycnique sur gradient de césium centrifugation à l’équilibre

12 2.3 centri 2. Préparation d'un extrait brut. 2.3. Séparation. Plan
on dépose l’échantillon au sommet du gradient 2.3 centri on mélange l’échantillonavec la solution gradient de saccharose solution de CsCl Les deux méthodes utilisent des gradients de densité comme l’isopycnique. Cependant, les deux méthodes ne suivent pas le même principe. Centrifugation La centri zonale répartie les molécules dans le surnageant ou le culot. Le gradient modifie les vitesses de sédimentation mais au final, tout se retrouverait au fond. Récupération des fractions La centri à l’équilibre répartit les molécules le long du gradient. Elles restent stationnaire à leur niveau de densité. On perce un trou dans le fond des tubes centrifugation zonale On sépare culot et surnageant. Les plus denses Les moins denses Les plus légères: dans le surnageant centrifugation à l’équilibre Les plus lourdes: dans le culot Plan

13 2.3 centri Plan centrifugation zonale Caractéristiques techniques
à l’équilibre Plan 2.3 centri On dépose des solutions de saccharose (ou de glycérol) de concentrations croissantes (d jusqu'à 1,3 g.mL-1) On mélange les composés à une solution de chlorure de césium (CsCl) C = 6 - 7,5 mol.L-1 d jusqu'à 1,9 g.mL-1 avantages: neutre électriquement pas cher inerte avantage: - on peut accéder à des densités élevées inconvénients: - visqueux à forte concentration - osmolarité inadaptée à un isolement de cellules entières inconvénients: coût composé de sels (donc chargé)

14 3.1.1 solv org + - + + - + - + + - + - + + -
Plan 3.1.1 solv org L'addition de solvant organique diminue la quantité relative d'eau dans la solution. Moins de molécules d'eau sont disponibles pour solubiliser le soluté. Les molécules de solvant (eau) polaires forment une couche autour des molécules de soluté chargées. Cette couche sépare les molécules entre elles et les solubilise. 3.1. Techniques de précipitation. * Solvants organiques. + Ils ne possèdent pas de spécificité d'action: ils précipitent lipides sucres et protéines (qu'elles soient des enzymes ou non!) Les solvants s'utilisent à température ambiante (attention, volatile) + + On peut agir sur la concentration en solvant. Principal inconvénient: les solvants ont tendance à dénaturer les protéines.

15 3.1.2 sol saline + - + + - + - + + - + - + + -
Lorsque la concentration en sel dépasse un certain seuil, l'effet s'inverse: les ions mobilisent une grande quantité d'eau, les protéines s'agglutinent et précipitent. L'addition d'ions augmente la couche chargée autour des protéines et augmente leur solubilité. 3.1. Techniques de précipitation. * Solution saline. + + + Salting in (solubilisation) Salting out (précipitation)

16 3.1.2 sol sal suite 3.1. Techniques de précipitation.
Plan Solutions salines. 3.1.2 sol sal suite Inconvénient: Les fortes concentrations ioniques peuvent dénaturer les protéines. Il est donc nécessaire d'éliminer les sels par dialyse. S = solubilité log S Salting in (solubilisation) Salting out (précipitation) µ = force ionique µ = ½ S.C.z2 z = charge de l'ion

17 3.1.3 pH + - + + - + - + + - 3.1. Techniques de précipitation.
La variation de pH modifie les charges portées par les chaînes latérales. * Variation de pH. + + Plan

18 3.1.3 pH suite 3.1. Techniques de précipitation.
Plan * Variation de pH. 3.1.3 pH suite S pH Charges globalement positives Charges globalement négatives pHi Attention: les changement de charges influent sur les liaisons de faibles énergies et modifient la conformation des protéines. Il y a donc risque de dénaturation.

19 et une phase mobile (éluant). En pratique, c'est plus compliqué !
3.3.1 principe Les chromatographies sont basées sur l'affinité d'un ligand pour une phase fixe (stationnaire) et une phase mobile (éluant). 3.3. Chromatographies. * Principe. Les facteurs qui interviennent dans l'affinité sont nombreux (masse, forme, charge, polarité,…). Les chances que deux protéines différentes possèdent les mêmes affinité pour les deux phases sont très faibles. Si le ligand présente une meilleure affinité pour la phase fixe, il est retenu et sa migration est lente. En principe, toutes les protéines d'un mélange peuvent être séparée par ces techniques. En pratique, c'est plus compliqué ! Si le ligand présente une meilleure affinité pour la phase mobile, il est entraîné et sa migration est rapide.

20 3.3.1 principe méca 3.3. Chromatographies.
* Principe: mécanisme. 3.3.1 principe méca forte affinité (pour la phase fixe) faible affinité (pour la phase fixe) Plus l’affinité de la molécule pour la phase stationnaire est grande, plus elle aura tendance à se fixer et à être ralentie.

21 Cette valeur d‘équilibre s’appelle le coefficient de partage.
3.3. Chromatographies. * Principe: coefficient de partage. 3.3.1 principe méca forte affinité (pour la phase fixe) fixation élution faible affinité (pour la phase fixe) Il existe un équilibre entre ligand fixé (à la phase fixe) et ligand libre (solubilisé dans la phase mobile). Cette valeur d‘équilibre s’appelle le coefficient de partage. Comparer avec les situations d’équilibres. Equilibre en faveur de la libération. La situation reste favorable à la fixation du ligand. L’équilibre est déplacé vers la libération du ligand. Equilibre en faveur de la fixation.

22 3.3.1 principe Vr/tr 3.3. Chromatographies.
* Principe: volume et temps de rétention. 3.3.1 principe Vr/tr La molécule très affine prend du retard par rapport à l’autre. Temps de rétention tr La valeur du coefficient de partage explique la vitesse d’élution (temps de rétention) et le volume de phase mobile nécessaire (volume d’élution). Il lui faut un plus grand volume d’éluant pour parcourir la colonne. Volume d’élution Ve

23 3.3.1 principe illustration
3.3. Chromatographies. Plan * Principe: volume et temps de rétention. mélange I du signal 3.3.1 principe illustration tr ou Ve Abs, trouble, fluorescence, conduction,... temps (temps de rétention: tr) volume (volume d’élution: Ve)

24 3.3.2 Efficacité N = 16 . (tr / w)2 = 5,54 . (tr / w1/2)2
Plan On peut exprimer l’efficacité en nombre de plateaux efficaces. C’est une vieille tradition héritée des colonnes à distillation. 3.3.2 Efficacité -----> caractérise la finesse des pics. On utilise: tr’ = tr – tr0 Performance d'une colonne. L’efficacité de la colonne est exprimée en nombre de plateaux. w 1/2 w * Efficacité. tr0 tr N = nbre de plateaux théorique N = 16 . (tr / w)2 = 5,54 . (tr / w1/2)2 N doit être le plus grand possible. à m-1 N’ = nbre de plateaux efficaces N = 16 . (tr’ / w)2 = 5,54 . (tr’ / w1/2)2 tr’ = (tr - tr0)

25 3.3.2 Sélectivité Plan 3.3.2. Performance d'une colonne.
-----> caractérise la séparation des pics. Performance d'une colonne. tr0 * Sélectivité. tr tr2 Cette valeur doit être comprise entre 1,05 et 2. k’ = facteur de capacité Plus la distance entre les pics est importante, meilleure est la séparation. a mesure la capacité de la colonne à séparer deux molécules. k’ = (tr – tr0) / tr0 a = facteur d’efficacité a = k’2 / k’1

26 3.3.2 Résolution R >> 1 R < 1 R = 1 Plan
La séparation est bonne si R > 1 Plan 3.3.2 Résolution -----> caractérise le recouvrement des pics. -----> finesse des pics (N) -----> distance entre les pics (a) Performance d'une colonne. a b * Résolution. wa wb tra trb Mauvaise séparation ! Il faut changer un paramètre de la chromatographie ! Pour les amateurs de jolies formules Ca reste raisonnable ! R = efficacité de séparation R = 2 . (trb - tra) / (wb - wa) R >> 1 R < 1 R = 1 2% de recouvrement

27 3.3.3 Chrom classique phase normale phase inverse très polaire
L'élution consiste à modifier la polarité de la phase mobile pour provoquer la solubilisation des molécules. Ces chromatographies sont basées sur la différence de polarité des molécules à séparer. 3.3.3 Chrom classique phase normale phase inverse phase stationnaire très polaire apolaire silice alumine cellulose silice + groupements carbonés apolaires C18, C8 phényl Chromatographie sur couche mince * Chromatographies "classiques". Chromatographie sur papier Chromatographie sur colonne polaire polaire phase mobile Eau + solvants organiques Eau + solvants organiques

28 3.3.3 Chrom classique suite Plan phase normale phase inverse polaire
L'élution consiste à modifier la polarité de la phase mobile pour provoquer la solubilisation des molécules. Plan 3.3.3 Chrom classique suite phase normale phase inverse La molécule est peu polaire. La molécule est très polaire. Très polaire Apolaire Très polaire polaire apolaire polaire Elle se "fixe" sur la phase stationnaire. Elle se "fixe" sur la phase stationnaire. Cette technique est utilisée pour la purification des protéines, des acides nucléiques,... Cette technique est peu adaptée pour la purification des protéines. La phase mobile devient de plus en plus polaire. La phase mobile devient de plus en plus apolaire. La molécule se solubilise. La molécule se solubilise.

29 3.3.4 échange ions -----> Echange d’anions.
La phase stationnaire porte une charge positive qui retient les anions. bille de séphadex DEAE diéthylaminoéthyl -----> Echange de cations. La phase stationnaire porte une charge négative qui retient les cations. CM sépharose = agarose + 2,3 dibromopropanol carboxyméthyl Amberlite IR 120 polystyrène + divinylbenzène sulfoné * Échange d'ions. - SO3-

30 Il existe deux méthodes d’élution.
* Échange d'ions. Il existe deux méthodes d’élution. Dans les deux cas, le principe est de « détacher » la molécule de son ligand de la phase stationnaire. 3.3.4 échange ions suite La modification du pH modifie l’état d’ionisation des fonctions des chaînes latérales responsables de la nature des liaisons de faible énergie impliqué dans les interactions protéine/ligand. -----> Modification du pH. NH+ HOOC -protéine -OOC -protéine pH = 4 pH = 6,2 Les variations de pH ont tendance à dénaturer les protéines. C’est pas toujours très bon... Cela modifie les capacités de la protéines à se lier sur la colonne.

31 Il existe deux méthodes d’élution.
* Échange d'ions. Il existe deux méthodes d’élution. Dans les deux cas, le principe est de « détacher » la molécule de son ligand de la phase stationnaire. 3.3.4 échange ions suite On utilise dans la solution éluante une autre molécule (souvent un sel) possédant une plus forte affinité pour la phase stationnaire et qui prend la place de la molécule. -----> Compétition avec un autre ligand. -OOC –CH3 NH+ -OOC -protéine La protéine est récupérée en bas de colonne. C’est le principe des compétitions vu en enzymologie. Il suffit de recycler la colonne en la rinçant avec un tampon acide par exemple.

32 3.3.4 échanges d’ions caract
* Échange d'ions. Plan La caractéristique d'une colonne est sa capacité. 3.3.4 échanges d’ions caract Capacité = nombre de groupements chargés que la phase stationnaire peut fixer par mL de gel Avantage: Technique peu chère, facile et applicable à toutes les protéines. Elle dépend: Nature du gel Nature de la protéine La porosité du gel de la phase stationnaire influence la faculté de diffusion des protéines en fonction de leur taille. La molécule doit posséder une charge suffisante par rapport à sa taille pour que sa masse ne la "décroche" pas. Inconvénient: Technique peu spécifique. Elle ne permet pas toujours une bonne séparation. Pour une grosse protéine: pH > pHi +1 sinon elle se décroche trop tôt.

33 encombrement stérique.
La phase stationnaire est composée de billes réticulées. Elles ne forment pas de liaisons mais constituent un réseau tri-dimensionnel qui trie les molécules en fonction de leur encombrement stérique. 3.3.5 filtrat gel principe On appelle également ce type de chromatographie: perméation sur gel ou chromato d’exclusion. * Filtration sur gel. migration du solvant billes de Séphadex

34 volume occupé par la molécule.
* Filtration sur gel. volume occupé par la molécule. 3.3.5 filtrat gel suite Volume d’élution Ve dépend de la taille de la molécule Ve/ V > log (M) log M Ve / V0 Volume total Vt = Vm + Vi On peut calculer une caractéristique de ce type de colonne: Kav = (Ve - V0) / (Vt - V0) C’est l’équivalent du coefficient de partage ! Plan Volume d’imprégnation Vi Volume mort V0

35 3.3.6 chrm affinité * 3. Purification. 3.3. Chromatographies.
Plan * 3. Purification. 3.3.6 chrm affinité La phase stationnaire est constituée d’un ligand spécifique de la protéine à purifier. 3.3. Chromatographies. Elution Par modification de pH - analogue de substrat d’une enzyme Risque de dénaturation irréversible - inhibiteur d’une enzyme (INC) - anticorps (la protéine est un antigène) Par compétition Il faut encore trouver un compétiteur adapté ! - CH2 – CH2 – CH2 - * Chromatographie d'affinité. ligand bras espaceur Technique relativement chère mais d’une spécificité incomparable. support

36 3.3.7 Chrom successives * Utilisations successives.

37 - + 3.4.1 principe 3.4. Electrophorèse. * 3.4.1. Principe.
Séparer des molécules chargées au travers d’un support poreux sous l’effet d’un champ électrique. 3.4. Electrophorèse. * Principe. - +

38 3.4.1 fact migr F = Q . E f = 6 . p . h . r . v F = f
3.4. Electrophorèse. * Principe. La migration dépend des conditions opératoires: 3.4.1 fact migr Mobilité. F = force E = intensité du champ électrique Q = charge de la molécule F = Q . E Frottement. f = force de frottement h = viscosité (dépend de la T) r = rayon de la molécule v = vitesse de migration f = 6 . p . h . r . v F = f A l’équilibre. Q . E = 6 . p . h . r . v v = Q . E / 6 . p . h . r Cette relation est souvent plus complexe: En pratique, la migration n’est pas linéaire Influence de la durée de migration. d = distance parcourue V = vitesse de migration t = durée d = V . t

39 - - + - - + + - + + + - 3.4.1 pvoir sep 3.4. Electrophorèse. Forme.
* Principe. La migration dépend de la nature de la protéine: 3.4.1 pvoir sep Forme. Peu variable d’une protéine soluble à l’autre (sauf si dénaturation) -----> peu d’influence sur le pouvoir de séparation Charge. Variable avec le pH - - + - - + + - + + + - pH > pHi pH = pHi pH < pHi charge nette = 0 -----> pas de migration charge nette > 0 -----> migration vers cathode charge nette < 0 -----> migration vers anode pH – pHi détermine l’intensité de la charge Q

40 induit une couche de charge +
3.4. Electrophorèse. * Principe. 3.4.1 courants électr La seule présence du support et de l’électrolyte induit des différences de charges qui réagissent au courant électrique et provoquent des mouvements parasites. Il s’agit du courant d’électro-endosmose. - + La présence du support induit une couche de charge + dans le solvant. mouvement de la phase liquide Couche mobile. Couche fixe. mouvement des protéines

41 3.4.1 courants évap - + 3.4. Electrophorèse. Plan * 3.4.1. Principe.
L’échauffement du au courant provoque une évaporation non négligeable de l’électrolyte. Celle-ci est responsable du courant d’évaporation. On peut prendre certaines précaution pour limiter ce phénomène. Fermeture de la cuve par un couvercle Cuve réfrigérée évaporation. + anode - cathode Mouvement du solvant.

42 3.4.2.1 veine liq Plan 3.4.2. Types d’électrophorèses.
on utilise un tube à section carrée: cela facilite les mesures optiques Types d’électrophorèses. * Electrophorèses en veine liquide. A Attention: la diffusion des solutés empêche d’obtenir des séparations nettes A + B C B + C mélange A + B + C A + B + C

43 = Electrophorèse de zone.
Plan élect support = Electrophorèse de zone. La phase stationnaire est un liquide « stabilisé » grâce à un support imprégné de tampon. Faut pas rêver! Ce n’est presque jamais le cas.. Types d’électrophorèses. Le support doit être homogène, poreux et inerte. * Electrophorèses sur support. types: papier en acétate de cellulose gel de polyacrylamide gel d’agarose (pour ADN) gel d’amidon gel de silice formes: bandes (papier,) lame (en immuno) tubes et plaques (gel)

44 3.4.3 polyacr Copolymérisation acrylamide bis-acrylamide
(N, N’-éthylène bisacrylamide) Catalyseurs: persulfate d’ammonium, tétraméthyl diamine (TEMED) Il permet la formation de radicaux libres (intermédiaire de la polymérisation) Formation d’un réseau par pontage des chaînes d’acrylamide par bis-acrylamide. * Electrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE). Le diamètre des pores dépend: - longueur chaînes acrylamide - degré pontage - % de bis-acrylamide * Préparation du gel. Le diamètre est proportionnel à l’inverse de la concentration de acrylamide + bis-acrylamide NB: si C > mailles serrées

45 En conditions non dénaturantes.
La séparation se fait en fonction: - de la charge de la protéine. - de la taille de la protéine. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE). Si le maillage est lâche, toutes les protéines migrent. Si le maillage est serré, seules les petites protéines passent, les grandes sont ralenties. * Conditions dénaturantes.

46 3.4.3. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE).
* Conditions dénaturantes. cond suite permet la dissociation des ponts disulfure En conditions dénaturantes. Traitement réducteur: b-mercaptoéthanol ou dithiothréitol HO - CH2 - CH2 – SH dodécylsulfate de sodium (SDS) CH3 - (CH2)10 - CH2 - SO42- 2.Na+ b-mercaptoéthanol SDS La migration s’effectue en fonction du nombre de SDS (chargés) fixés, c’est à dire en fonction de la longueur de la protéine (1 SDS tous les deux AA). C’est un détergent anionique: il se fixe aux protéines et les "déroule"

47 Plan 4 * 4. Révélation. * 4.1. Coloration. * 4.2. Radioactivité.
* Technique immunologique: Western blot. * 4. Révélation.

48 4.1 coloration * 4.1. Coloration. Bleu de Coomassie
En milieu acide, le colorant s'adsorbe sur la protéine ce qui modifie son pic d'absorption (du rouge vers le bleu à 595 nm) Bleu de Coomassie (méthode de Bradford) 4.1 coloration * Coloration. Il se fixe particulièrement sur Arg, Tyr, Trp, His et Phe. Le bleu est sensible aux détergents comme le SDS. PLAN

49 4.2 radioact * 4.2. Ligand radioactif. PLAN
L’émission de radioactivité impressionne un film photographique et provoque l’apparition d’une tâche. * Ligand radioactif. On incorpore un isotope radioactif (3H, 32P,...) à la protéine en formation - au ligand utilisé

50 4.2 radioact * Ligand radioactif.

51 4.3 tech imm - + * 4.3. Technique immunologique: Western blot. PLAN
Électrophorèse sur gel. 4.3 tech imm Transfert sur membrane Révélation spécifique * Technique immunologique: Western blot. buvard buvard gel membrane

52 stacking