SEMINAIRE DE FORMATION CONTINUE : LES INFECTIONS RESPIRATOIRES Prise en charge de l’adulte immunocompétent avec une pneumonie aiguë Quels examens microbiologiques.

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1 SEMINAIRE DE FORMATION CONTINUE : LES INFECTIONS RESPIRATOIRES Prise en charge de l’adulte immunocompétent avec une pneumonie aiguë Quels examens microbiologiques demander ? Dans quelles circonstances ? Pr. M Maurin Laboratoire de bactériologie-virologie CHU de Grenoble

2 Pneumonie aiguë communautaire Définition: infection des alvéoles et bronchioles pulmonaires, due à des bactéries, des virus, des parasites ou des mycètes Rmq: la pneumonie est la seule infection respiratoire aiguë pour laquelle un retard de l’antibiothérapie a été associé à un risque plus élevé de mortalité

3 Étiologies des pneumonies en fonction du lieu de traitement File T.M. Community-acquired pneumonia. The Lancet 2003; 362:1991-2001 AmbulatoireHôpitalSoins Intensifs S. pneumoniaeS. pneumoniaeS. pneumoniae M. pneumoniaeM. pneumoniaeLegionella sp. H. influenzaeC. pneumoniaeH. influenzae C. pneumoniaeH. influenzaBGN Virus *Legionella sp.S. aureus PNO aspiration virus * * Influenza A et B, adénovirus, VRS, parainfluenza

4 Étiologies des pneumonies nécessitant une hospitalisation File T.M. Community-acquired pneumonia. The Lancet 2003; 362:1991-2001 8 séries Virus*1-23% Bactéries pyogènes16.1-80% -Streptococcus pneumoniae11-48% -Haemophilus influenzae2.7-11% -Staphylococcus aureus1.4-5% -Moraxella catarrhalis0-3% -Entérobactéries1-11% -Pseudomonas0-2% * Influenza, adénovirus, VRS, parainfluenza

5 Étiologies des pneumonies nécessitant une hospitalisation File T.M. Community-acquired pneumonia. The Lancet 2003; 362:1991-2001 8 séries Bactéries intracellulaires (« atypiques »)2.5-58.8% -Mycoplasma pneumoniae2.5-32.5% -Chlamydophila pneumoniae0-16.3% -Legionella0-8% -Chlamydophila psittaci0-1% -Coxiella burnetii 0-1% Mycobacterium tuberculosis1.4-8.9% Pneumocystis sp.0-8% Infections mixtes2-11%

6 Épidémiologie des agents de pneumonies communautaires Flore humaine endogène : -Virus : transmission inter-humaine, par voie aérienne -S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis : bactéries commensales de l’oro-pharynx -Staphylococcus aureus : portage rhino-pharyngé ~30% de la population -Entérobactéries : bactéries commensales du tube digestif bas -M. pneumoniae, C. pneumoniae : portage oro-pharyngé, transmission inter-humaine par la salive

7 Épidémiologie des agents de pneumonies communautaires Flore environnementale : -Pseudomonas : réservoir hydrique, aérosols -Legionella : réservoir hydrique, aérosols -Pneumocystis sp.: réservoir environnemental mal connu Zoonoses : -Chlamydophila psittaci : psittacidés (perruches, perroquets), aérosols -Coxiella burnetii : animaux domestiques et familiers, aérosols (lait non pasteurisé) Mycobacterium tuberculosis : pathogène strictement humain, transmission inter-humaine par voie aérienne

8 Quand et pourquoi demander une documentation microbiologique au cours d’une pneumonie ? Quand ? -pneumonie grave, nécessitant une hospitalisation -pneumonie sur terrain particulier (BPCO, cardiopathie, immunosuppression, …) -contexte épidémiologique particulier (épidémie) Pourquoi ? -évaluation du pronostic -adaptation du traitement antibiotique -intérêt épidémiologique

9 Documentation microbiologique: Hémoculture  sensibilité faible positives dans ~10% des cas de pneumonies communautaires positives dans 10 à 30% des pneumonies à S. pneumoniae  mais spécificité de 100% si germe isolé responsable de PNO seul examen permettant d’affirmer une étiologie +++

10 Documentation microbiologique: culture du liquide pleural  Rarement pratiquée à titre diagnostique  sensibilité faible : < 10%  mais spécificité bonne si germe isolé responsable de PNO Car prélèvement considéré comme non souillé

11 Documentation microbiologique: culture de l’expectoration Prélèvementseuil (cfu/ml)  crachats> 10 7  aspiration bronchique> 10 5  lavage broncho-alvéolaire> 10 4  brossage bronchique> 10 3  biopsie pulmonairenon Technique  examen direct: PNN, micro-organismes +++  culture adaptée à une flore polymicrobienne  quantification de la flore pathogène  cultures spécifiques : Legionella, Mycobacterium, M. pneumoniae, C. pneumoniae, Virus

12 Documentation microbiologique: culture de Legionella  rarement visible au Gram +++  culture en milieu spécifique: BCYE-  fer, L-cystéine, charbon  délai : 3 à 7 jours  sensibilité < 50% ~20% des cas diagnostiqués en Europe  spécificité = 100%  identification d’espèce et de sérogroupe  typage moléculaire (AFLP, PFGE, MLST)

13 Documentation microbiologique: culture M. pneumoniae et C. pneumoniae  Bactéries non visibles au Gram +++  culture en milieux spécifiques:  M. pneumoniae : milieu SP4  C. pneumoniae: cellules eucaryotes (BGMK, Hep-2)  Culture lente : 3 à 4 semaines ou plus  sensibilité < 10%  spécificité = 100%  Cultures rarement pratiquées en routine

14 Documentation microbiologique: culture de M. tuberculosis  Coloration de Ziehl Neelsen  culture en milieu solide : Lowenstein Jensen, délai : 3 à 4 semaines  culture en milieu liquide : Middlebrook, délai de 10-15 jours  sensibilité ~80% sur expectorations  spécificité = 100%  Identification du groupe tuberculosis par sonde moléculaire en 24h

15 Documentation microbiologique: culture de l’expectoration Intérêts:  importance de l’examen direct +++  isolement d’un germe permet un antibiogramme  Intérêt épidémiologique (SPRP) Limites:  faible sensibilité (bactéries fragiles)  très faible spécificité +++  flore pathogène / commensale  bactéries et virus difficilement ou non cultivables  quantification très approximative

16 Documentation microbiologique: antigène urinaire Legionella pneumophila sg1  détection spécifique des antigènes de L. pneumophila sg 1  ELISA, tests immuno-chromatographiques sur membrane (ex. Now TM Legionella, coût ~22  )  urines concentrées, délai : ¼ h à 2 h, mais sensibilité  10%  sensibilité :  70 à >90% pour L. p sg 1,  14 à 65% pour L. p sg 2-15  < 10% pour L. non pneum.  spécificité : 99 %  faux négatifs et faux positifs rares

17  333 cas prouvés par isolement d’une souche  sg 1 = 281(88.6%), sg 2-15= 48, non typables = 4 Infections communautaires (n=148) Infections nosocomiales (n=67) Infections liées aux voyages (n=118) Sensibilité du Binax EIA 86.5 %44.2 %93.7 % Sensibilité du Biotest EIA 76.0 %45.7 %94.4 % Helbig J.H. J. Clin. Microbiol. 2003; 41:838-40 Antigène urinaire Lp1: communautaire versus nosocomial

18 Antigène urinaire Lp1 : durée d’excrétion  61 patients avec pneumonie et antigénurie à L. pneumophila  suivi de l’antigénurie sur urines concentrées (x 25)  test négatif à 2 mois pour 75% des patients  persistance si immunosuppression, ou fièvre après 72h de traitement Sopena N. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2002; 21: 845-8

19 Documentation microbiologique: antigène urinaire S. pneumoniae  recherche d’antigènes de S. pneumoniae excrétés dans les urines  test immuno-chromatographique sur membrane (ICT)  détecte le polysaccharide C donc « tous les sérotypes »  facile et rapide (~15 min)  peu influencé par une antibiothérapie préalable  Coût ~ 22.0  (hémoculture aérobie ~ 1.4  ) Test Binax Now S. pneumoniae

20 Dominguez J. Chest 2001 ; 119 :243-9 Patients Hôpital Universitaire Germans Trias i Pujol, (Barcelone, Espagne) groupe 1 : 51 patients avec pneumonie à pneumocoque certaine - 28 isolement de S. pneumoniae en hémoculture (~ 55%) -23 détection d’Ag capsulaire polysaccharidique dans les urines par CIE groupe 2 : 16 patients avec pneumonie à pneumocoque probable : gram et/ou culture sur expectorations positifs à pneumocoque groupe 3 : 71 patients contrôles - 28 pneumonies d’étiologie autre que pneumocoque - 12 bactériémies d’étiologie autre que pneumocoque - 31 infections urinaires groupe 4 : 16 patients présentant une pneumonie d’étiologie inconnue Documentation microbiologique: antigène urinaire S. pneumoniae

21 Résultats Test urinaire Binax Now Pneumo positif chez : - 41/51 patients avec pneumonie à S. pn. certaine : sensibilité = 80.4% soit 23/28 (82.1%) bactériémiques soit 18/23 (78.3%) non bactériémiques - 7/16 patients avec pneumonie à pneumocoque probable (43.7%) - 2/71 (2.9%) contrôles soit une spécificité de 97.1% (pneumonie à L. pneumophila, et septicémie à B. fragilis) - 11 sérotypes différents détectés chez les 24 patients bactériémiques (pas de spécificité de sérotype)

22 Guttierez F. Clin Infect Dis 2003 ; 36 :286-92 Patients Hôpital Général Universitaire de Elx (Alicante, Espagne) octobre 1999 à octobre 2001, score de Fine 493 patients adultes admis pour pneumonie communautaire antibiothérapie préalable chez 114 / 493 (23%) des patients Tests - 2 hémocultures, ECBC - urines pour Binax Now Legionella et S. pneumoniae (x 25 à 50 fois) - 2 sérums (Legionella, Coxiella, C. pneumoniae, C. psittaci, M. pneumoniae, Influenza A et B, Parainfluenza, VRS, Adénovirus) Documentation microbiologique: antigène urinaire S. pneumoniae

23 Analyse des résultats  prévalence du pneumocoque dans la population étudiée : 27 / 493 = 5% des CAP, 13.9% des cas documentés  évaluation du test Binax S. pneumoniae / cas documentés  Sensibilité = 70.4 %, VPP = 54.3%  Spécificité = 89.7%, VPN = 94.6% Guttierez F. Clin Infect Dis 2003 ; 36 :286-92 Critères de diagnostic étiologique - hémoculture ou culture de liquide pleural positives - isolement en flore prédominante dans un ECBC de bonne qualité - multiplication par 4 au moins des titres sérologiques

24 Documentation microbiologique: les sérologies des pneumonies « atypiques »  1 sérum unique = diagnostic possible  2 sérums, phase aiguë puis convalescence (après 3-4 semaines) = diagnostic certain  diagnostic rétrospectif +++  Sensibilité faible  Spécificité bonne : peu de réactions croisées aux seuils définis  Intérêt limité pour la prise en charge immédiate des patients  Test de référence dans toute étude étiologique de pneumonies Plouffe J.F. Importance of atypical pathogens of community-acquired pneumonia. Clin. Infect. Dis. 2000; 31suppl.2:35-39

25 Documentation microbiologique: les sérologies des pneumonies « atypiques »  M. pneumoniae : RFCp, ELISA, IgM et IgG - infection certaine : x 4 des titres ou séroconversion - infection aiguë si présence IgM ? - infection probable: titre > seuil (RFCp > 64)  C. pneumoniae : IFA, ELISA, IgM et IgG - infection certaine : x 4 des titres ou séroconversion - infection aiguë si présence IgM ? - infection probable : IgG > 512 ou IgM > 16  Legionella spp. : IFA, (Lp sg 1-6) x 4 des titres et > 128 ou titre unique > 256  C. burnetii : IFA (antigènes phase II) x 4 des titres et IgG > 200 ou IgM > 50 ou IgG > 200 Plouffe J.F. Importance of atypical pathogens of community-acquired pneumonia. Clin. Infect. Dis. 2000; 31suppl.2:35-39

26 Intérêt d’un diagnostic microbiologique extensif au cours des CAP  262 patients, dec. 1998-nov. 2000, âge moyen = 64 ans  Hémocultures, culture liq. pleural, culture crachats, Ag. urin. Legionella et S. pneumoniae, sérologies (intracellulaires, virus)  Étiologie identifiée pour 158 / 262 (60%) patients : S. pneumoniae (37%), M. pneumoniae (9%), H. influenzae (7%), L. pneumophila (5%), etc.  Étiologie mixte (17, 6%) : bactérie + atypique ou bactérie + virus  Rendement diagnostique pour les cas documentés : –Gram positif 40/44 adéquats (91%)- sérologies 34/262 (13%) –Culture crachat 36/44 (82%)- Ag pneumo / urines 52/262 (20%) –Hémoculture 40/254 (16%)- Ag Legionella / urines 12/262 (5%) –Culture LBA/brossage bronchique 32/64 (50%) Van der Eerden. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2005; 24:241-249

27 Documentation microbiologique: techniques d’amplification génique  PCR, PCR en temps réel  prélèvements respiratoires, sérum, urines, etc.  gènes cibles : spécifiques de chaque pathogène  sensibilité analytique < 10 ufc/ml  intérêt / viabilité bactérienne, antibiothérapie préalable  délai : 4 à 6 heures +++

28 Documentation microbiologique: techniques d’amplification génique  sensibilité très variable en fonction du pathogène et du type de prélèvement considéré  spécificité : en général > 98%  faux négatifs : inhibiteurs de la Taq polymérase  faux positifs :  Pas de différentiation flore commensale / pathogène (ex. S. pneumoniae, H. influenzae, BGN)  ADN contaminant (ex. L. pneumophila et Kits d’extraction ADN !)

29 Documentation microbiologique: amplification S. pneumoniae  129 patients avec pneumonie communautaire –Hémoculture positive à S. pneumoniae: 11/112 testées –Culture expectoration positive à S. pneumoniae: 19/114 testées –99 non S. pneumoniae, dont 43 avec autre étiologie identifiée  Real time PCR : seuil de positivité à 3.7 x 10 4 copies de génomes / ml expectoration (défini par courbe ROC)  À ce seuil : –Sensibilité = 90%- VPP = 58.7% –Spécificité = 80%- VPN = 96.2%  VPP faible, mais sensibilité de la culture faible !  Pb du choix de la méthode standard, Pb du portage ! Yang S. J. Clin. Microbiol. 2005; 43:3221-3226

30 Documentation microbiologique: amplification C. pneumoniae  22 C. pneumoniae, 29 espèces contrôles : sensibilité et spécificité de 100%  50 pvmts respiratoires (épidémie à C. pneumoniae 1994)  TETR-PCR versus nested-PCR contrôle  16 TETR-PCR et nested-PCR pos  28 TETR-PCR et nested-PCR neg  6 discordances, dont 2 faux positifs en TETR-PCR  Sensibilité = 90%,Spécificité = 93.3%  Pb du choix de la méthode standard, Pb du portage ! Madico G. J. Clin. Microbiol. 2000; 38:1085-1093

31 Documentation microbiologique: amplification M. pneumoniae  M. pneumoniae, M. fermentans, M. hominis, M. genitalium, M. orale, M. buccale, M. salivarium, M. pirum, M. arthritidis, U. urealyticum et 12 espèces contrôles : sensibilité et spécificité de 100%  117 pvmts respiratoires (LBA, BA, asp. nasales)  100 PCR M. pneumoniae négatives  17 PCR M. pneumoniae positives  16S rRNA real time NASBA versus PCR contrôle  Sensibilité 94.1% rt NASBA / PCR, Spécificité = 100%  Pb du choix de la méthode standard, Pb du portage ! Loens K. J. Clin. Microbiol. 2003; 41:4448-4450

32 Documentation microbiologique: amplification L. pneumophila 23S-5S  Real time PCR, Cible: région intergénique 23S-5S  Sondes d’hybridation Legionella spp. ou L. pneumophila  Sensibilité, spécificité = 100% sur 40 souches de Legionella  17 patients avec légionellose (culture, antigène urinaire, séroconversion)  versus 23 contrôles: autres causes de pneumonie  Sensibilité = 94%, spécificité = 100%  Pas de portage asymptomatique ?! Herpers B.L. J. Clin. Microbiol. 2003; 41:4815-6 Possibilité de différentier L. pneumophila des autres espèces du genre

33 Documentation microbiologique: PCR multiplex : Chlamylege ® (Argene Inc.) Ginevra C. J. Clin. Microbiol. 2005; 43:3247-3254  PCR multiplex : M. pneumoniae, C. pneumoniae, Legionella  Étude de souches :  Contrôles pos : 9 Mp, 65 Lp 1-15, 38 Leg. non pneumophila  Contrôles neg : 6 Candida, 2 champignons, 16 bactéries  Sensibilité et spécificité analytiques = 100%  30 pvmts respiratoires chez 18 patients infectés par un des trois pathogènes, sensibilité = 100%  220 aspirations nasopharyngées, enfants, hiver 2003-4  Chlamylege / rt PCR « maison » : 98.6% de concordance  4 C. pneumoniae et 6 M. pneumoniae pour les 2 tests  + 2 M. pneumoniae et 1 Legionella sp. pour le Chlamylege  116 négatifs (86 asp nas, 28 asp endotr): spécificité=100%

34 Documentation microbiologique: rt PCR multiplex : Pneumoplex ® (Prodesse Inc.)  rt PCR (sondes à hydrolyse)  L. pneumophila  L. micdadei  Chlamydophila pneumoniae  Mycoplasma pneumoniae  Bordetella pertussis Khanna M. J. Clin. Microbiol. 2005; 43:565-571  125 LBA testés :  100 artificiellement contaminés  soit 20 LBA x 5 pathogènes  25 contrôles négatifs  Sensibilité = 100 %  Spécificité = 98.5 %

35 Documentation microbiologique: quel bilan ?  ~ 5-10% de l’ensemble des pneumonies communautaires sont documentées  ~ 60% des pneumonies communautaires nécessitant une hospitalisation sont documentées  S. pneumoniae demeure le 1er pathogène en fréquence  S. pneumoniae et L. pneumophila sont les pathogènes les plus redoutables en terme de mortalité  Apport du diagnostic microbiologique à la prise en charge initiale des pneumonies: Gram de l’expectoration, hémocultures, antigène urinaire L. pneumophila sg1, PCR et rt PCR ?