Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET 1 Dénombrement ou numération automatisée des cellules sanguines Principes par impédancemétrie.

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1 Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET 1 Dénombrement ou numération automatisée des cellules sanguines Principes par impédancemétrie par diffraction de la lumière par analyse en flux Résultats de l’hémogramme

2 Année 2008 2 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET Principe COULTER par impédancemétrie - Cuve contenant une solution saline conductrice du courant électrique aspirée par le micro orifice d’un tube de verre Générateur de courant constant I Voltmètre mesurant la tension U aux bornes du circuit Électrodes placées de chaque côté du micro orifice entre lesquelles existe une impédance Z Z est constant U = Z.I = constant + Le dispositif de mesure Le flux passant par le micro orifice ne contient que la solution d’électrolytes

3 Année 2008 3 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET Principe COULTER par impédancemétrie Les cellules sanguines sont mauvaises conductrices de l’électricité -+ Chaque cellule, mauvaise conductrice du courant électrique, passant par le micro orifice fait augmenter l’impédance entre les deux électrodes de mesure L’aspiration entraîne les cellules à passer les unes après les autres au travers du micro orifice Z  donc U = Z.I 

4 Année 2008 4 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET Principe COULTER par impédancemétrie Les cellules sont comptées et mesurées après amplification du signal. Les impulsions peuvent être visualisés sur un oscilloscope : U en fonction du temps Il y a proportionnalité entre l’impulsion de tension et la taille de la cellule Temps U Possibilité de choisir les populations selon leur taille avec des seuils au-delà ou en deçà desquels les cellules ne sont pas prises en compte

5 Année 2008 5 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET Principe COULTER par impédancemétrie Possibilité de classer les populations en fonction leur taille : Histogrammes de distribution (%(relatif) en fonction du volume) % PlaquettesGlobules rouges Double seuilPhénomène de coïncidence* fL * Passage du micro orifice par deux cellules à la fois, donnant une petite sous population de volume double, n’existant que sur de grandes populations et corrigé de façon statistique au niveau de la numération des globules rouges (mais visible sur l’histogramme de distribution) Discrimination entre hématies et thrombocytes, dénombrés dans la même dilution, basée sur leur volume respectif

6 Année 2008 6 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET Principe par diffraction lumineuse Dispositif de mesure Mise en flux pour étude individuelle au niveau de la zone d’inspection Cellule de mesure où est focalisé un faisceau lumineux Source lumineuse monochromatique Flux d’échantillon Volume d’inspection vide Aucun signal mesuré Arrêt du faisceau lumineux

7 Année 2008 7 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET Principe par diffraction lumineuse Les cellules sanguines diffractent la lumière Présence d’une cellule dans la zone d’inspection -> Diffraction de la lumière débordant l’écran et venant exciter une cellule photoélectrique Détection d’un signal Comptage et mesure de la cellule

8 Année 2008 8 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET Autres mesures en flux Possibilité de multiples mesures effectuées en même temps au niveau de la zone d’analyse du flux Mesure du flux lumineux diffracté à petit angle : Estimation de la complexité de la forme du noyau Mesure du flux lumineux diffracté à grand angle : Estimation de la granularité du cytoplasme Mesure du flux lumineux transmis : Dosage de l’hémoglobine sur suspension après lyse des hématies Estimation du volume du noyau des cellules nucléées

9 Année 2008 9 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET Autres mesures en flux Possibilité de multiples mesures effectuées en même temps au niveau de la zone d’analyse du flux Mesure du courant de haute fréquence transmis Estimation de la densité du noyau

10 Année 2008 10 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET Autres mesures en flux Possibilité de multiples mesures effectuées en même temps au niveau de la zone d’analyse du flux Mesure du flux lumineux passant le filtre avec dénombrement et identification des cellules portant le marqueur Présence d’ARN marqué : réticulocytes Cellules marquées par des marqueurs fluorescents spécifiques Filtre spécifique

11 Année 2008 11 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET Autres mesures en flux Possibilité de multiples mesures effectuées en même temps au niveau de la zone d’analyse du flux Cellules marquées par des marqueurs fluorescents spécifiques Filtres spécifiques Mesure du flux lumineux passant le filtre : Dénombrement et identification des cellules portant le marqueur Présence d’anticorps spécifiques de cellules : par exemple T4/T8

12 Année 2008 12 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET Exemples de résultats d’hémogramme Bilan érythrocytaire GR2,7 Hb12,2 Ht35 VCM128 TCMH45 CCMH34,5 IDC18 Numération des globules rouges en 10 12 /L Dosage de l’hémoglobine en g/dL Hématocrite en % Volume Cellulaire Moyen ou VGM en fL Teneur Cellulaire Moyenne en Hémoglobine en pg Concentration Cellulaire Moyenne en Hémoglobine en g/dL de GR Indice de Distribution Cellulaire appelé aussi RDW ou IDR = coefficient d'anisocytose < 15 % = valeur statistique correspondant ETx100/VGM ET Pop GR anormale (IDC > 15 %) VGM Observation des hématies sur frottis coloré au MGG pour constater l’anisocytose ou autres anomalies de forme

13 Année 2008 13 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET Exemples de résultats d’hémogramme Bilan thrombocytaire Plt 35 VPM9 VPM Numération des plaquettes en 10 9 /L Volume Plaquettaire Moyen en fL Deux histogrammes l’un représentant les valeurs mesurées l’autre les valeurs extrapolées Population plaquettaire anormale (courbes dissociées) Observation de l’aspect des plaquettes sur frottis coloré au MGG pour constater la présence d’un nombre de plaquettes diminué et une hétérogénéité de taille

14 Année 2008 14 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) POCHET Exemples de résultats d’hémogramme Bilan leucocytaire Réalisé sur une suspension sans érythrocytes ni plaquettes (lyse) 2,9 40 50 8 1 1 1.15 1.45 0.2 0.05 0.05 GB Ne Ly Mo Eo Ba Histogramme de distribution tridimensionnel Deux axes : volume en fonction de la diffraction Code couleur donnant la 3 ième dimension : Bleu faible Vert moyen Rouge important Jaune très important Seuils positionnant les populations normales neutrophiles lymphocytes monocytes éosinophiles Basophiles non visibles sous cette représentation Restes leucocytaires, amas de plaquettes et/ou érythroblastes % 10 9 /L Pop GB anormale (seuil mal défini entre Ly et Mo) Vérification de la formule leucocytaire sur lame