Régulation transcriptionnelle des gènes  Régulation Distale : Facteurs Cis- et Trans-régulateurs  Activateurs : Enhancers => Activation de la transcription.

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2 Régulation transcriptionnelle des gènes  Régulation Distale : Facteurs Cis- et Trans-régulateurs  Activateurs : Enhancers => Activation de la transcription  Inhibiteurs : Silencers => Inhibition de la transcription  Insulateurs : Insulators => Isolement de régions d’ADN à certaines régulations ▶ Insulateurs barrières: empêchent la propagation de l’hétérochromatine (chromatine fermée) ▶ Enhancer-blocking insulators: bloquent l’action d’enhancers. => Facteur CTCF (CCCTC-binding Factor)  Régulation Proximale : Machinerie Transcriptionnelle Introduction

3 Régulation transcriptionnelle des gènes  Régulation Distale : Mécanisme d’action  Looping model : Création de boucles d’ADN pour permettre aux éléments régulateurs à distance d’entrer en contact direct avec le promoteur d’un gène cible. => Importance de la signature conformationnelle de la chromatine dans la régulation génique [Heintzman et al., 2009] Introduction Adaptée de [Wang et al., 2012]  Sites DHS : DNase I hypersensitive sites => Accessibilité de la chromatine à des facteurs de transcription.

4  Régulation du gène CFTR  Conséquences de régulations à distance sur le gène CFTR ? Modèle d’étude Locus CFTR ? Génotypes non établis Variabilités phénotypiques Fine régulation CFTR non expliquée Analyse de l’organisation chromatinienne d’un large locus CFTR (~ 800kb) : – Technique 5C “Chromosome Conformation Capture Carbon Copy "  Origine Mucoviscidose : Mutations du gène CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator

5 Chromosome Conformation Capture Carbon Copy  Approche à haut débit => Technique de Copie Conforme de 3C, qui permet de mesurer des milliers d’interactions chromatiniennes en une analyse.  Dostie J. et coll. (2006) Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements - Genome res. " Librairie 3C" " Librairie 5C " Techniques d’étude de la conformation de la chromatine

6  Modèles cellulaires : Comparaison de cellules primaires de volontaires sains, exprimant différemment le gène CFTR : + Cellules épithéliales nasales (HNEC) : expression CFTR. - Fibroblastes de peau (SF) : Ø expression CFTR.  Moisan et al. (2015), NAR. Matériels et Méthodes Analyses 5C

7  Région d’étude ~ 790 kb : => Gène CFTR + 511 kb en 5’ + 83 kb en 3’.  Moisan et al. (2015), NAR. Analyses 5C Matériels et Méthodes  Domaines associés :  Datas Hi-C : => Gène CFTR présent dans un TAD qui s’étend du gène ST7 au gène ANKRD. => Ce TAD est chevauché par un second qui s’étend du gène MET au gène ASZ1. => Gène CFTR présent dans un sub- TAD qui s’étend du gène ASZ1 au gène CTTNBP2.  Locus d’étude CFTR :  Design amorces 5C : => 140 amorces forward le long du locus + 2 amorces reverse au niveau du promoteur CFTR.

8 Techniques d’étude de la conformation de la chromatine Adaptée de [van Berkum et al., 2010] Adaptée de http://blmoore.bitbucket.org/edbio et [Ong and Corces, 2014]  Mesure de l’ensemble des interactions chromatiniennes du génome: " All versus all "  Description de la segmentation du génome en domaines topologiquement associés : TADs Topologically Associated Domains.  TADs séparés par des régions barrières, " boundary regions ", où sont souvent retrouvés des sites de fixation aux facteurs CTCF. Matériels et Méthodes

9  Région d’étude ~ 790 kb : => Gène CFTR + 511 kb en 5’ + 83 kb en 3’.  Moisan et al. (2015), NAR. Analyses 5C Matériels et Méthodes  Domaines associés :  Datas Hi-C : => Gène CFTR présent dans un TAD qui s’étend du gène ST7 au gène ANKRD. => Ce TAD est chevauché par un second qui s’étend du gène MET au gène ASZ1. => Gène CFTR présent dans un sub- TAD qui s’étend du gène ASZ1 au gène CTTNBP2.  Locus d’étude CFTR :  Design amorces 5C : => 140 amorces forward le long du locus + 2 amorces reverse au niveau du promoteur CFTR.

10  5C Heatmaps :  Profils d’interaction de 3 librairies de fibroblastes de peau et 3 librairies HNEC : => 70 % des interactions SF se situent au niveau de la région promotrice du gène CFTR. => Promoteur CFTR HNEC est plus engagé dans des interactions à distance avec le locus. => Interactions plus importantes au niveau du sub-TAD. Expression de CFTR et interactions longue-distance  Moisan et al. (2015), NAR. Résultats

11  Comparaison des fréquences d’interaction de librairies de fibroblastes de peau et de cellules HNEC :  Identification de régions interagissant préférentiellement avec le promoteur CFTR dans les cellules nasales. Interactions CFTR et éléments de régulation  Moisan et al. (2015), NAR. Résultats

12  Alignement des fréquences d’interaction des librairies HNEC avec des marqueurs de régulation des cellules SAEC (Small Airway Epithelial Cells) :  Corrélation entre des régions interagissant préférentiellement avec le promoteur CFTR et des sites d’accessibilité de la chromatine (DHS) et / ou des sites de fixation du facteur CTCF.  Moisan et al. (2015), NAR. Résultats Interactions CFTR et éléments de régulation

13  Tests d’activité enhancer :  Mesure de l’activité du gène rapporteur luciferase après clonage du promoteur CFTR (1667pb) et des différentes régions isolées, dans le pGL3 Basic- vector (Promega) par la technique In fusion dans des cellules 16HBE14o- : Activité enhancer des régions DHS interagissant avec le promoteur CFTR => Identification de 2 régions régulatrices, en amont et en aval du gène CFTR, qui coopèrent pour augmenter son expression.  Moisan et al. (2015), NAR. Résultats

14  Analyses ChIP CTCF :  Les enhancers E et G sont situés de part et d’autre du gène CFTR au niveau des limites du sub-TAD.  Des alignements de séquence dans différents types cellulaires montrent la présence de sites de fixation au facteur CTCF au niveau de ces 2 régions.  Moisan et al. (2015), NAR. Résultats Modèle de régulation 3D du locus CFTR

15  Analyses ChIP CTCF :  Moisan et al. (2015), NAR. Résultats Modèle de régulation 3D du locus CFTR => Les enhancers E et G activent le promoteur CFTR grâce au recrutement de facteurs CTCF qui permettent la formation d’une boucle chromatinienne.  Analyses ChIP dans les cellules HNEC montrent la fixation du facteur CTCF au niveau des 2 régions régulatrices E et G.

16  1ère étude de l’organisation chromatinienne du locus CFTR avec la technique 5C sur des cultures primaires humaines. => Mise en évidence de nouveaux contacts chromatiniens avec le promoteur CFTR. => Identification d’un nouvel effet coopératif entre 2 éléments régulateurs du gène CFTR. => Démonstration d’un model 3D de régulation du gène CFTR. Conclusion Analyses 5C - Locus CFTR

17  INSERM UMR 1078 : Pr Claude Férec Génétique, Génomique Fonctionnelle et Biotechnologies 46 rue Félix le Dantec - Brest - France  Dostie Lab : Department of Biochemistry McIntyre Medical Science Building, Room 815 - Montreal, Quebec, Canada