Croissance des Microorganismes en Laboratoire

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1 Croissance des Microorganismes en Laboratoire
Milieux de Croissance

2 Buts Croissance sous des conditions contrôlées Maintien
Isolation de cultures pures Évaluer la présence et le nombre de microorganismes

3 Types Liquides (bouillons) Milieux Solides
Permets la culture en suspension Distribution uniforme des éléments nutritifs, environnementaux et autres Permets la croissance de grands volumes Milieux Solides Mêmes que milieux liquides + agent de solidification L’agar : Polysaccharide dérivé d’une algue

4 La Croissance en Bouillon
Non-inoculé Limpide Turbide + sédiment Turbide Limpide + sédiment

5 Croissance sur Gélose Croissance sur surface solide Croissance isolée
Permets l’isolation de colonies simples Permets l’isolation de cultures pures Colonie simple

6 Milieux Solides (suite)
Pente Croissance en surface et en profondeur Différentes disponibilités d’oxygène Entreposage à long terme Tube profond Milieu semi-solide Entreposage à long terme Faible disponibilité d’oxygène

7 Compter les Microorganismes

8 Méthodes Mesure de turbidité Comptes viables Nombre le plus probable
Comptes directs

9 Mesure de la Turbidité  Mesure la quantité de lumière qui peut traverser un échantillon Le moins de lumière qui traverse l’échantillon le plus dense est la population Mesure la densité optique ou le pourcentage de transmission

10 Mesure de la Turbidité Spectrophotomètre (A600):
Mesure de la Densité Optique Lumière 600nm Détecteur….lecture Lecture différente

11 Relation inverse 2.0 1.0 D.O. 600nm % Transmission 100 50
2.0 1.0 D.O. 600nm % Transmission 100 50 Densité cellulaire Relation inverse

12 Comptes Directes L’échantillon à être énuméré est appliqué sur une lame d’hématimètre qui retient un volume fixe dans une cellule de comptage Le nombre de cellules est compté Le nombre de cellules dans le volume donné est déterminé

13 Hématimètre Cette lame possède 2 cellules de comptage indépendante

14 Déterminer le Compte Direct
Compter le nombre de cellules dans trois carrés indépendants 8, 8 et 5 Déterminer la moyenne ( )/3 =7 Donc 7 cellules/carré

15 Déterminer le Compte Direct (suite)
1mm Profondeur: 0.1mm 1mm Calculer le volume d’un carré: = 0.1cm X 0.1cm X 0.01cm= 1 X 10-4cm3 ou ml Diviser le nombre moyen de cellules par le volume d’un carré Donc 7/ 1 X 10-4 ml = 7 X 104 cellules/ml

16 Avantages: Désavantages: Rapide Aucune croissance requise
Aucune information a propos de l’organisme est requise Désavantages: Ne discrimine pas entre vivant et mort Peux être difficile de discriminer entre les bactéries et les détritus

17 Problème Un échantillon est appliqué à une lame d’hématimètre dont les cellules de comptage ont les dimensions suivantes: 0.1mm X 0.1mm X 0.02mm et qui possèdent 100 carrés. Des comptes de 6, 4 et 2 cellules ont été faits dans trois carrés indépendants. Quel est le volume d’une cellule de comptage? Quel est le volume d’un carré? Quel est le nombre de cellules par millilitre dans l’échantillon?

18 Comptes Viables Cellule viable: une cellule capable de se diviser et de générer une population (ou colonie) Un compte viable est fait en diluant l’échantillon original Étaler des échantillons des dilutions sur un milieu de culture approprié Incuber sous les conditions appropriées pour permettre la croissance Des colonies sont formées Les colonies sont comptées et le nombre original de cellules viables est déterminé en fonction de la dilution

19 Dilution d’un Échantillon de Bactéries

20 Dilution d’un Échantillon de Bactéries

21 Dilution d’un Échantillon de Bactéries

22 Dilution d’un Échantillon de Bactéries

23 Dilution d’un Échantillon de Bactéries
5672 57 4

24 Comptes Viables  Le nombre total de cellules viables est indiqué en tant qu’Unité Formatrice de Colonies (UFC) plutôt que nombre de cellule Chaque colonie est originaire d’une unité formatrice de colonie (UFC) Une plaque avec colonies est choisie Calcul: Nombre de colonies sur la plaque X la réciproque de la dilution (facteur de dilution)= Nombre d’UFC/mL Ex. 57 UFC X 106 = 5.7 X 107 UFC/mL

25 Compte Viable Avantages: Désavantages:
Dénombre les microorganismes viables Peut distinguer différents microorganismes Désavantages: Pas de milieu universel Nécessite la croissance du microorganisme Seule les cellules vivantes génèrent des colonies Des amas ou des chaînes de cellules génèrent une seule colonie UFC  une bactérie Ex. Un UFC de Streptococcus  un UFC d’E.coli

26 Nombre le Plus probable: NPP
Fondé sur les statistiques de probabilités Test présomptif fondé sur des caractéristiques données Technique en bouillon

27 Nombre le Plus Probable (NPP)
Commencer avec un bouillon qui permet de déceler les caractéristiques désirées Inoculer differentes dilutions de l’échantillon à être testé dans chacun de 3 tubes Dilution 3 Tubes/Dilution 1 ml de chaque dilution dans chaque tube Après une période d’incubation approprié, enregistrer les TUBES POSITIFS (qui ont de la CROISSANCE et les caractéristiques désirées)

28 NPP- Suite L’objectif est de DILUÉ l’organisme à zero
Après l’incubation, le nombre de tubes qui démontre les caractéristiques désirées sont enregistré Exemple de résultats pour une suspension de 1g/10 ml de terre Dilutions: Tubes positifs: Choisir la bonne suite: 321 et la retrouver dans le tableau Multiplier le résultat par le facteur de dilution central 150 X 102 = 1.5 X 104/mL Puisque vous avez 1g dans 10mL doit multiplier encore par 10 1.5 X 105/g

29 Visualiser les Microorganismes
Microscopie - Les Colorations

30 Colorations Simples Coloration positive Colorations négatives
Coloration du spécimen Coloration indépendante de l’espèce Colorations négatives Coloration de l’environnement de fond

31 Méthode Coloration simple: Un seul agent de coloration
Permet de déterminer la taille, la forme, et l’arrangement des cellules

32 Les Formes Cellulaires
Coccus: Sphères Division sur 1,2 ou 3 plans Nombre de plans de division donne différents arrangements Arrangements typiques de différents genres bactériens

33 Les Cocci (Coccus) Plans de division Arrangements Diplococcus
Streptococcus (4-20) Tétrade Staphylococcus Indice: si le nom du genre de bactéria finisse par coccus, la forme de la bactérie est cocci

34 Les Formes Cellulaires (suite)
Bacilles: Bâtonnets Division sur 1 plan seulement Arrangements typiques de différents genres bactériens

35 Les Bacilles Plans de division Arrangements Diplobacille
Streptobacille Eg. Clostridium = bacille Indice: si le nom du genre de bactérie finisse par bacille, la forme de la bactérie est bacille Si elle ne finisse pas par cocci, c’est probablement une bacille.

36 Coloration différentielle Coloration de Gram
Divise les bactéries en deux groupes Gram Négatives & Gram Positives

37 Gram Positives Colorées Mauves Bacille Coccus
Genres: Bacillus et Clostridium Coccus Genres: Streptococcus, Staphylococcus et Micrococcus

38 Gram Négatives Colorées Rouges Bacille: Coccus:
Genres: Escherichia, Salmonella, Proteus, etc. Coccus: Genres: Neisseria, Moraxella et Acinetobacter

39 Règles Si le nom est bacillus et/ou clostridium
= Gram (+), bacille Si le nom finisse par coccus ou cocci (autre que les 3 exceptions, qui eux sont Gram (-)) = forme de coccus et Gram (+) Si ça fait pas partie des règles ci-dessus, = Gram (-) bacilles

40 Paroi Cellulaire Gram + Vs Gram - Paroi Peptidoglycane Membrane
Couche de Lipopolysaccharide Absente Paroi Peptidoglycane Membrane Plasmique

41 Méthode - Coloration Primaire
+ Coloration avec le cristal violet Ajout d’iode de Gram (Mordant) + + Paroi :peptidoglycane LPS Membrane plasmique Gram positif Gram Négatif

42 Méthode - Étape Différentielle
Lavage à alcool Paroi est déshydratée – Complex colorant + iode est piégé Paroi n’est pas déshydratée – Complex n’est pas piégé Paroi :peptidoglycane LPS Membrane plasmique + + Gram positif Gram Négatif

43 Méthode - Contre Coloration
+ Coloration avec la Safranine + + Paroi :peptidoglycane LPS Membrane plasmique + Gram positif Gram Négatif

44 Sommaire Fixation Coloration primaire Violet de cristal Lavage
Décoloration Contre coloration Safranine

45 Coloration Acido-Alcoolo-Résistante
Coloration diagnostique de Mycobactérium Pathogènes de la Tuberculose et de la Lèpre Paroi cellulaire avec acide mycoïque Cireuse, très imperméable

46 Méthode Principe: Contenu élevé de composés similaires aux cires dans la paroi cellulaire, Acide Mycoïque, rend ces bactéries très résistantes aux colorants

47 Méthode (Suite) La paroi est rendue perméable par la chaleur
Coloration avec de la fuchsine basique À base de phénol, soluble dans la couche mycoique Refroidissement retourne la paroi à son état imperméable Colorant est piégé Lavage avec de l’alcool acide Étape différentielle Mycobactéries retiennent le colorant Autres bactéries perdent le colorant

48 Coloration de Spores Spores: Cellule bactérienne différentiée
Résistante à la chaleur, la déshydratation, les ultraviolets, et différents traitements chimiques Alors, très résistante aux colorant aussi! Typique des bacilles Gram positifs Genres Bacillus et Clostridium Conditions défavorables induisent la sporogénèse Différenciation de cellule végétative à l’endospore E.g. Anthrax

49 Coloration au Vert de Malachite
Spores (structures résistantes utilisées pour la survie dans des conditions défavorables) Sporangium (strucutre dans laquelle les spores se forment) Endospore (dormant, non reproductrices) Cellules végétatives (en croissance active) Perméabilisation des spores par la chaleur Coloration primaire au vert de malachite Lavage Contre coloration à la safranine