METHODES D’ETUDE DE LA CELLULE

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1 METHODES D’ETUDE DE LA CELLULE

2 I. METHODES D’OBSERVATION DE LA CELLULE
A. La microscopie optique 1) Microscopie optique ou photonique classique : microscope à fond clair 2) Le microscope à contraste de phase 3) Le microscope à fluorescence B. La microscopie électronique 1) Le microscope électronique à transmission 2) Le microscope électronique à balayage (MEB) C. Types d’observations réalisables grâce aux microscopes 28/04/17 II. METHODES DE SEPARATION ET DE PURIFICATION GUEDES Isabel 1) Tri cellulaire

3 Preparation des objets
Etalement cellulaire Obtenir une monocouche de cellules facilement observable. Exemple: un frottis sanguin. 28/04/17 lymphocyte GUEDES Isabel On prélève une goutte de sang on la dépose à une extrémité de la lame et à l’aide d’une lamelle, on étale les cellules. Les cellules vont ensuite être fixées (voir plus loin) et pourront être soit colorées directement soit utilisées pour l’immunocytochimie lymphocyte lymphocyte

4 Obtention d’un objet fin
Culture cellulaire: ensemble de techniques pour faire croître des cellules hors de leur organisme ou de leur milieu d’origine dans de but de une analise ou experimentation. 28/04/17 GUEDES Isabel

5 Obtention d’un objet fin
Si on veut étudier la structure cellulaire in situ, dans son tissu ou dans l’organe, il faut réaliser des coupes minces de ce tissu. On dispose de différentes techniques pour obtenir ces coupes minces. Enrobage en paraffine Congélation Le processus est pareil a l’antérieur, sauf qu'il faut une étape de cryoprotection dans une solution de sucrose pour que le glace ne rompe pas les cellules. Le microtome utilise en cet case permettre de maintenir la température environ -20ºC. 28/04/17 1 - objet 6 - microtome 3 - fixation 5 - enrobage 7 - montage pour observation 2 - segmentation 4 - déshydration GUEDES Isabel

6 Coupé ou tissue sans parafine
La coloration Coupe en paraffine Coupé ou tissue sans parafine Il faut rehydrater le tissue pour que les colorants hidrossolubles puissent rentre dans la celule. Le colorant s’utilize directemente et depend de quelle organite ill fault contrasté. Les colorants les plus utilisés sont: l’hématoxyline qui colore le noyau en bleu-noir et l’éosine qui colore le cytoplasme et la matrice extracellulaire en rose. 28/04/17 GUEDES Isabel Coloration hématoxyline éosine d’un système digestif de souris

7 Le microscope à contraste de phase
Objectif : augmenter les contrastes d’objet peu ou pas coloré, in vivo, p.e. Principe La lumière en traversant un objet va modifier son trajet optique (réfraction) et donc être en déphasage par rapport à la lumière ayant traversé le milieu. Les microscopes sont construits avec des filtres que augmentent ou diminuent les contrastes 28/04/17 GUEDES Isabel b) Utilisation Ce type de microscope sert à observer des cellules vivantes, non colorées. Il permet de voir les déplacements cellulaires, la division cellulaire et de suivre dans le temps par microcinématographie les modifications cellulaires.

8 Le microscope à fluorescence
But visualiser des détails d’une préparation ou mettre en évidence une catégorie d’objets, organites ou même molécules. Technique en pleine expansion. Technique permettant la visualisation d’objets très fins. Observation de cellules qui expriment, par mutagenèse, une molécule fluorescente dont le gène a été couplé à un gène spécifique de la cellule : exemple de la GFP, protéine fluorescente émettant dans le vert, qui est très utilisée pour suivre certains lignages cellulaires. 2 - Utilisation dans le cadre de l’immunocytochimie (ou de l’hybridation in situ) : les fluorochromes servent de marqueurs pour détecter la réaction antigène-anticorps Il existe actuellement de très nombreux fluorochromes ; parmi les plus anciennement utilisés : la fluorescéine qui absorbe la lumière bleue et émet une fluorescence intense jaune-vert ; la rhodamine absorbe la lumière vert-jaune et émet une lumière rouge. (Illustration plus loin). Un des grands intérêts de la fluorescence est de pouvoir faire des marquages multiples en utilisant différents fluorochromes. 28/04/17 GUEDES Isabel As propriedades fluorescentes hoje usadas em mic de fluorescencia foras descobertas em “meduses” . Isolou-se o gene com pacacidade de prod fluiorescencia Funde-se o gene ao gene da proteina que que quer seguir conseguindo-se assim visualizar in vivo a estrutura pretendida. – mutagénese – eng genética Pode tb ligar-se esta prot numa prot de uma estrura que se queira visualizar – fagossomas da foto de células da glia de neurónios humanos. 2 – os fluorocromos são ulizados para detetar proteinas nas células utilizando reações imunitarias (imunocitoquimica, ié reação antigene-anticorpo) Fluorocromos são todas as moléculas utilizadas em microscopia com o objetivo de obter fluorescencia. Há fluorocromos especificos para certas moleculas como ac nucleicos (DNA e RNA) Muitas vezes utiliza-se uma combinação de tecnicas de fluorescencia (hibridação, antigene, anticorpo e coloração) para vizualizar não só uma mas um conj de estruturas numa célula ou tecido.

9 Le microscope confocal
la lumière émise en un point donné soit quasi la seule détectée grâce au passage de la lumière par une très petite ouverture appelée ouverture confocale. Le microscope, qui utilise comme lumière un faisceau laser, balaie la préparation en plans successifs qui seront donc tous « au point » et l’ordinateur reconstituera l’image à partir de l’ensemble des points. 28/04/17 GUEDES Isabel Laser scanning confocal microscopy represents one of the most significant advances in optical microscopy ever developed, primarily because the technique enables visualization deep within both living and fixed cells and tissues and affords the ability to collect sharply defined optical sections from which three-dimensional renderings can be created. The principles and techniques of confocal microscopy are becoming increasingly available to individual researchers as new single-laboratory microscopes are introduced. Development of modern confocal microscopes has been accelerated by new advances in computer and storage technology, laser systems, detectors, interference filters, and fluorophores for highly specific targets. • Intérêt du microscope confocal Il élimine le bruit de fond et permet de localiser plus précisément la fluorescence : on peut par exemple mieux distinguer si un marquage est vraiment sur la membrane cytoplasmique et non pas également dans le cytoplasme.

10 le pouvoir de résolution
Cést la distance minimal (D) qui doit séparer deux points pour qu'ils soient correctement discernés. D= 0,61λ/ Nsinα N = l’indice de le moyen de refraction α est le demi-angle d’ouverture du cône lumineux On peut obtient une resolution téorique maximal de 0,2 microns. Pour observer la structure interne de la cellule et mettre en évidence les organites, il faut donc un microscope à pouvoir de résolution beaucoup plus puissant : microscope électronique 28/04/17 GUEDES Isabel

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